实验方法

磷酸酶 a 的测定实验

难度系数: 暂无得分

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基本方案

实验原理

4-α-D-葡聚糖:正磷酸-α-D-葡萄糖基转移酶。


酶断裂多糖的α-1,4-糖苷键:

(葡萄糖)n+Pi →(葡萄糖)n-1+葡萄糖-1-P


实验中反应与葡萄糖磷酸变位酶偶联:

葡萄糖-1-P → 葡萄糖-6-P


并且 6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化:

葡萄糖-6-P+NADP → 葡萄糖酸-6-P+NADPH+H

实验材料

磷酸酶 a

仪器/耗材

分光光度计

实验步骤

实验所需「试剂」具体见「其他」


0.98 ml 实验混合物


0.02 ml 酶样品


25 ℃ 时,于 340 nm 处吸收值降低,ε340=6.3×103 l/(mol·cm)。

注意事项

其他

试剂:


0.05 mol/L 磷酸钾,pH 6.8


0.01 mol/L EDTA(Mr=292.3,29.2 mg 溶于 10 ml 水中)


糖原(60 mg 溶于 10 ml 水中)


1 mmol/L 1,6-二磷酸葡萄糖(脂鲤环己基铵盐,Mr=736.8;7.4 mg 溶于 10 ml 水中)


0.01 mol/L NADP(Mr=787.4;79 mg 溶于 10 ml 水中)


1 mol/L MgCl2(Mr=203.3,六水合物,2 g 溶于 10 ml 水中)


葡萄糖磷酸变位酶 100 U/mg(100 U/ml 溶液)


6-磷酸葡萄糖脱氢酶,200~400 U/mg(300 U/ml 溶液)。两种酶在使用之前,都要用游离的铵盐制备。如果外加了硫酸铵悬浮液,在用前必须用 0.05 mol/L 磷酸钾 pH 6.8 透析。

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