实验方法

质粒 DNA 的转化实验

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基本方案

实验原理

转化活性是检测质粒生物活性的重要指标,在基因克隆技术中,转化(transformation)是特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组质粒 DNA(包括人工染色体)导入细胞的过程, 是一种常用的基本实验技术。 该过程的关键是受体细胞的遗传学特性及其所处的生理状态,用于转化的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,以防止对导入的外源的切割,用 R- M- 符号表示。 此外,为了便于检测,受体菌一般应具有可选择的标记(例如抗生素敏感性、颜色变化等)。 但质粒 DNA 能否进入受体细胞则取决于该细胞是否处于感受态(competence)。所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源 DNA 的一种生理状态,可通过物理化学的方法诱导形成,也可自然形成(自然感受态)。 在基因工程技术中,通常是采用诱导的方法。 大肠杆菌是常用的受体菌,其感受态一般是通过用 CaCl2 在 0℃ 条件下处理细胞而形成,基本原理是: 细菌处于 0℃ 的 CaCl2 低渗溶液中,会膨胀成球形,细胞膜的通透性发生变化,转化混合物中的质粒 DNA 形成抗 DNase 的羟基一钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经 42 ℃ 短时间热激处理,促进细胞吸收 DNA 复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖,在选择培养基上便可获得所需的转化子。

实验材料

大肠杆菌 PUC18 质粒

实验步骤

1. 制备感受态细胞


1.1 将大肠杆菌 HB101 在 LB 琼脂平板上划线,37℃ 培养 16~20 h。


1.2 在划线平板上挑一个单菌落于盛有 20 ml LB 培养基的 250 ml 三角瓶中,37℃ 振荡培养到细胞的 OD600 值为 0.3~0.5 之间,使细胞处于对数生长期或对数生长前期。


1.3 将培养物于冰溶中放置 10 min,然后转移到 2 个 10 ml 预冷的无菌离心管中,4000 r/min,0℃~4℃ 亡离心 10 min。


1.4 弃上清,倒置离心管 1 min, 流尽剩余液体后,置冰溶 10 min。


1.5 分别向二管加入 5 ml 用冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液悬浮细胞, 置冰浴中 20 min。 CaCl2 的纯度至关重要,不同厂家,甚至同一厂家不同批号的产品,均影响感受态的形成。


1.6 4000 r/min,0℃~4℃ 离心 10 min 回收菌体, 弃上清。分别向二管各加入 1 ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液,重新悬浮细胞,


1.7 按每份 200 ul 分装细胞于无菌小塑料离心管中,如果不马上用可加入终浓度为 10% 的无菌甘油,置 -20℃ 或 -70℃ 存备用。


制得的感受态细胞,如果在 4 ℃ 放置 12~24 h, 其转化率可增高 4~6 倍,但 24 h 后,转化率将下降。


以上均严格无菌操作。


2. 转化


2.1 加 10 ul 含约 0.5 ug 自制的 pUC18 质粒 DNA 到上述制备的 200 ul 感受态细胞中。 同时设三组对照:不加质粒;不加受体;加已知具有转化活性的质粒 DNA。具体操作参照下表进行。


2.2 将每组样品轻轻混匀后,冰浴 30~40 min, 然后置 42℃ 水浴热激 3 min, 迅速放回冰浴 1~2 min。


2.3 向每组样品中加入等体积的 2×LB 培养基,置 37℃ 保温 1~1.5 h, 让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。


2.4 每组各取 100 ul 混合物涂布于含氨苄青霉素(50 ug/ml)的选择平板上,室温下放置 20~30 min。


2.5 待菌液被琼脂吸收后,倒置平板于 37℃ 培养 12~16 h,观察结果。

注意事项

其他

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