1) 细胞置于冰上冷却，吸去培养液并以4℃的PBS洗涤，吸去PBS。

2) 如欲研究细胞表面抗原，则以2% PFA于冰上固定30 min。如研究细胞质抗原，则 可用含0.1% Triton×-100的2% PFA于冰上固定30 min,或以100%甲醇在普通冰箱的结冻室（-10〜-20℃)固定15 min。

两种固定细胞质抗原的方法均可获满意结果。然而，用高聚甲醛/Triton×-100固定通常可获更佳 的形态学观察结果，如采用甲醇固定法，应确保细胞在放入冰箱以前，先用甲醇充分予以洗涤，否则细胞会冻结。使用与泵连接的巴斯德吸管抽吸液体。

3) 吸去固定液，用4℃的PBS洗2次（5 min/次)。稀释的第一抗体于4℃用微量离心机以13 500 g离心2 min。

4) 加第一抗体于培养皿中，使其恰好覆盖细胞，4℃温育1 h。然后用4℃的PBS洗4次 (5 min/次)。

5) 稀释的第二抗体在4℃用微量离心机以13500 g离心2 min。

6) 加入第二抗体，4℃温育1 h。然后用4℃的PBS洗4次。

7) 若不想立即观察细胞，则将细胞于PBS中存放。盖好培养皿，以铝箔包裹，冷藏。 在24 h内观察此实验结果是很重要的，因荧光会迅速减弱或与细胞解离。

如用LabTek细胞培养玻片，可取玻片以Gelvatol进行封片处理。