一、PCR 反应实验程序

1.准备 PCR 反应混合物：根据 DNA 样本的数量来确定除了 DNA 外其他混合物的体积（额外增加一份来确保有足够的 PCR 反应混合物），将扩增每一个遗传标记并且在每一个 PCR 反应管内分 19.5uL 的反应混合物。

2.在每个管子中加 0.5, 的 DNA 样本。

3.如果不用带有加热盖的 PCR 仪，那么就需要在每个管子的顶部加入矿物油来防止液体蒸发。

4.把管子放在 PCR 仪中，95℃加热 3 min 变性 DNA。

5.95℃ 变性 40s、55℃ 引物退火 40s、72℃ 延伸 40s，循环 30-35 次。

6.72℃ 终末延伸 7 min。

7.把 PCR 产物和尿素上样缓冲液 1:1 混合.

二、将 PCR 产物行测序胶（6% 胶，21 cmX40 cmX0.4 mm)

1.配制胶溶液：将 25 g 尿素、7.5 mL40% 丙烯酰胺：PDA(19:1)、IOmL5XTBE 加入到 250 mL 的锥形瓶中。加蒸馏水至 50 mL。充分混匀来溶解尿素 (见注释 4)。

2..准备制胶板：把胶板洗干净-确保上面没有灰尘。用硅化玻璃板。根据各个厂家的不同把玻璃板夹在一起并且用胶条封住底部（这一过程根据设备的不同而有所变化)。

3.加入 500uL 10% 的过硫酸铵到胶混合液中并且通过滤纸过滤。

4.取出 10mL 胶溶液加入到一个小烧杯中并且加 10~15 斗 TEMED。马上将胶倒到板上。几分钟之内胶将聚合到一起，封玻璃板的底部。

5.封好胶后，加 15ul 的 TEMED 到剩余的胶溶液中并且马上把胶倒到两块胶板之间。仔细插入胶梳子，让胶聚合 2 h 至过夜。

6.取下胶底部的封条。把胶放在电泳槽中确保电极插入的方向正确。将胶槽中灌满 1XTBE.(大约 1.5L，根据装置的不同量有所不同）。拔掉胶梳子，用 IXTBE 冲洗上样孔。

7.把胶预热 60 min 直到温度在 50℃ 左右。

8.在上样之前再次用加样器冲洗上样孔。在每个孔中加 1?10/xL 的产物和上样染料（上样量根据梳子的大小和 PCR 产物的浓度而不同）。根据产物片段大小的不同跑胶时间可以从 30 min 到 3 h 之间变化。

三、银染

1.用一张 3 mm 厚的印迹纸把胶从测序胶装置上取下。胶将粘到滤纸上直到把胶放在甲醇/冰乙酸溶液中才会游离。

2.切掉胶的底部，这样它将适合放在耐热烤盘中而不至于自己卷曲。在每个步骤中用足够的溶液将胶浸没（大约 300 mL)。在染胶过程中尽可能避免用手触摸胶。把胶铺平避免折叠，用戴手套的手轻触胶的角。在每一步的过程中，把胶留在盘中，将旧洗液倒干净（可以用一片塑料板或一张洗过的带有小孔的 X 线片把胶轻轻地拿起来)。

3.在耐热盘中倒入新鲜配制的 10% 甲醇/10% 冰乙酸，将胶浸泡 15 min，同时轻轻摇动耐热盘使液体循环流动。

4.在 10% 的乙醇溶液中将胶冲洗 5 min。

5.把胶浸在 0.5% 的硝酸溶液中恰好 30s。

6.把胶用水充分冲洗 2 次。

7.把胶浸在 0.012mol/L 的硝酸银溶液中 15~30 min。

8.快速充分的冲洗胶（用水把胶洗 2 次，任何洗不掉的硝酸银都将产生沉淀，在胶上产生点状沉积。胶不应该在水中浸泡时间过长因为银离子也可以被洗掉)。

9.把胶浸在 300 mL 的显色液中（当液体颜色变为棕色就应更换新液体)。

10.再用水冲洗一次。

11.把胶浸在 10% 的冰乙酸中至少 2 min 来终止反应。

12.用水冲洗胶。

13.用干胶器在两块玻璃纸之间干胶或者把胶放在 3 mm 的印迹纸上并且用包装纸覆盖顶部。

注释

1.DNA 通常是从 5~10mL 新鲜全血中提取获得。我们通常选择盐析技术而不选择酚。如果仅仅需要提取一定数量的样品而不需要高质量的 DNA 用于其他目的，那么可以制备初级裂解产物。DNA 也可以从其他组织中提取，例如，从简单的口腔冲洗液中提取的 DNA，其数量可以用于多个 PCR 反应 [24]。如果仅能得到很少量的 DNA，那么对这些 DNA 的预扩增将很有用。

2.引物可以通过定制合成（如果需要的量很大）。

3.在标准扩增条件下，2 h 内将完成 3 个循环的 DNA 合成。当为一些特殊的引物优化扩增条件时要考虑以下几种因素：

（1）没有扩增或扩增很弱：试着降低几度退火温度，引物浓度加倍，逐步升高镁离子浓度或者增加 3~5 个循环数。

（2）太多非特异扩增：试着降低循环数，调节镁离子浓度，增加退火温度 2~5℃，降低 Taq 酶的浓度。

（3）没有产生引物二聚体扩增产物或者很弱：试着降低引物浓度，增加上面提到的不扩增时采用的步骤。

4.如果不用银染，那么正常使用 bis(亚甲双丙烯酰胺，iV，V-methylenebisacrylamide) 而不使用 PDA。PDA 是一种特殊的交联剂，用来减少银染背景的同时可以使胶更结实，这种交联剂对于在银染过程中用手移动胶是必需的。用 bis 的交联剂能够用于银染，但是由于胶很脆，这种交联剂仅能用于小胶。