阳离子多糖的合成及体外转染
实验原理
阳离子多糖的合成及体外转染
材料
试剂
联辛可宁酸（B C A ) 试 剂 盒（Pierce)
(3 -gal ELISA 试 剂 盒（Roche) 或 (3 -gal 检测试剂盒（Invitrogen)
磷酸钙试剂（S i g m a-Aldrich)
待 转 染 细 胞 ，如
C 3 H 10T 1/2
H E K 293
C H O
H eL a
N IH 3T 3
EPC
COS-7
葡 聚 糖（平 均 分 子 质 量 40kD a) (Sigma-A ldrich )
胎 牛 血 清（FBS) (Beit Haemek, Israel)
谷 氨 酷 胺（4nm ol/L ) (B eit H aem ek ， Israel)
HEPES■缓冲生理盐水（HBS; 150 mmol/L NaCl， 20nmol/L HEPES， pH7.1)
用0.2um膜过滤除菌或高压灭菌于 4°C 保 存 。
人生长激素（hGH) ELISA 试 剂 盒（Roche)
盐酸羟胺
磷脂配方
D O T A P /C h o l 1/1 (A vanti P o lar Lipids Inc. , A labam a)
T ra n sfa st (P rom ega)
F u G E N E 6 (R oche)
萤光素酶报道基因检测试剂（R o c h e) 或萤光素酶检测试剂盒（P r o m e g a )
培养基
完全培养基： DMEM，含 10% (m/m) 胎 牛 血 清（FBS)、 0.2 mmoI/L L -谷氨酰胺、 lmg/m l 青霉素， IOOUAnl 链霉素
D M E M (D ulbecco’s m odified E agle’s m edium )
氮 气（储存复合物用）
青 霉 素（Beit H aem ek ， Israel)
质 粒
pEGFP-C l, C M V 启 动 子 ；pLN Cluc 质 粒 ，含 萤 火 虫 萤 光 素 酶 基 因 ；pLacZ, SV4 0 或CM V 启动子；pCM VhGH 用 于 定 量 及定性分析。使 用 Nucleobond AX 500 柱（Machery-Nagel， Duren， Germany) 或 QIAGEN Plasmid Mega Kit (Hilden， Gerimany) 纯 化 质 粒 。D N A 的浓度通过磷的含量确定，磷含量代表了 D N A 负 电 荷 的 量。
高 碘 酸 钾（K I O 4) (Sigma-Aldrich)
硼 氢 化 钠（N a B H 4) (S i gma-Aldrich)
精 胺（S i gma-Aldrich)
链 霉 素（Beit H a e m e k ， Israel)
仪器
纤维素透析管（截留分子质量 3500)
6 孔细胞培养板
D o w e x - I (醋酸盐型）阳离子交换树脂
突光显微镜（M o d e l Axiovert 35， Zeiss, Jena, G e r m a n y )
冻干机
分光光度计， N M R (核磁共振波谱仪），红外
方法
阳离子多糖的合成：葡聚糖的氧化
1•将葡聚糖（l 〇 g ， 62.5m m 〇 l 糖单元）溶 于 200m l 二次去离子水中。
2.以 I : 1 的摩尔 比（糖单元/IO4-) 加入高碘酸钾，室温下避光搅拌 6〜8 h 。
3 . 通 过 D owex- 1 离子交换柱除去 I O r 及未反应的 I O r ， 纯化聚醛。再用二次去离子水4°C 透 析（纤维素透析管，截留分子质量 3500) 3d 。
4 . 冻干纯化后的聚醛衍生物。产物为白色粉末。
平均产率为 7 0 % 。 FT-IR (KBr) 在 1724 cm-1 观察到 C= O 吸收峰。
5.通过羟氨盐酸盐滴定测定聚醛含量（Z h a o and Heindel 1991)。
寡胺键合
6•将氧化后的葡聚糖（l g ， 0.75〜6. 56m m o l 醛基）溶 于 I O O m l 二次去离子水中。将其缓慢滴加到 50m l 含 有 5 0 % 过量精胺的硼酸盐缓冲溶液中。
7 . 室温下搅拌 2 4 h 。 加 人 N a B H 4 (l g ， 4 倍醛基摩尔数），将亚胺还原成 胺 。 继续搅拌 48 h 。
8•另用 N a B H 4 (l g ， 4 倍醛基摩尔数），反 应 24 h , 重复还原。
9•将亮黄色溶液转移到透析管中（纤维素透析管，截留分子质量 3500)，用二次去离子水 4°C 透 析 3d 。
1 〇•冻干透析产物，氮气条件下储存。平均产率为 5 0% (OT/m )。通过对产物的核磁共振分析得到产物的氨基比例。（m ) 多重峰，（H ) 质子氢。
细胞数除以视野内的总细胞数计算转染效率（转染百分比)。
在有些情况下，基因表达可以用标准 BCA 试剂盒检测蛋白总量，对结果归一化
实验步骤
阳离子多糖的合成及体外转染
材料
试剂
联辛可宁酸（B C A ) 试 剂 盒（Pierce)
(3 -gal ELISA 试 剂 盒（Roche) 或 (3 -gal 检测试剂盒（Invitrogen)
磷酸钙试剂（S i g m a-Aldrich)
待 转 染 细 胞 ，如
C 3 H 10T 1/2
H E K 293
C H O
H eL a
N IH 3T 3
EPC
COS-7
葡 聚 糖（平 均 分 子 质 量 40kD a) (Sigma-A ldrich )
胎 牛 血 清（FBS) (Beit Haemek, Israel)
谷 氨 酷 胺（4nm ol/L ) (B eit H aem ek ， Israel)
HEPES■缓冲生理盐水（HBS; 150 mmol/L NaCl， 20nmol/L HEPES， pH7.1)
用0.2um膜过滤除菌或高压灭菌于 4°C 保 存 。
人生长激素（hGH) ELISA 试 剂 盒（Roche)
盐酸羟胺
磷脂配方
D O T A P /C h o l 1/1 (A vanti P o lar Lipids Inc. , A labam a)
T ra n sfa st (P rom ega)
F u G E N E 6 (R oche)
萤光素酶报道基因检测试剂（R o c h e) 或萤光素酶检测试剂盒（P r o m e g a )
培养基
完全培养基： DMEM，含 10% (m/m) 胎 牛 血 清（FBS)、 0.2 mmoI/L L -谷氨酰胺、 lmg/m l 青霉素， IOOUAnl 链霉素
D M E M (D ulbecco’s m odified E agle’s m edium )
氮 气（储存复合物用）
青 霉 素（Beit H aem ek ， Israel)
质 粒
pEGFP-C l, C M V 启 动 子 ；pLN Cluc 质 粒 ，含 萤 火 虫 萤 光 素 酶 基 因 ；pLacZ, SV4 0 或CM V 启动子；pCM VhGH 用 于 定 量 及定性分析。使 用 Nucleobond AX 500 柱（Machery-Nagel， Duren， Germany) 或 QIAGEN Plasmid Mega Kit (Hilden， Gerimany) 纯 化 质 粒 。D N A 的浓度通过磷的含量确定，磷含量代表了 D N A 负 电 荷 的 量。
高 碘 酸 钾（K I O 4) (Sigma-Aldrich)
硼 氢 化 钠（N a B H 4) (S i gma-Aldrich)
精 胺（S i gma-Aldrich)
链 霉 素（Beit H a e m e k ， Israel)
仪器
纤维素透析管（截留分子质量 3500)
6 孔细胞培养板
D o w e x - I (醋酸盐型）阳离子交换树脂
突光显微镜（M o d e l Axiovert 35， Zeiss, Jena, G e r m a n y )
冻干机
分光光度计， N M R (核磁共振波谱仪），红外
方法
阳离子多糖的合成：葡聚糖的氧化
1•将葡聚糖（l 〇 g ， 62.5m m 〇 l 糖单元）溶 于 200m l 二次去离子水中。
2.以 I : 1 的摩尔 比（糖单元/IO4-) 加入高碘酸钾，室温下避光搅拌 6〜8 h 。
3 . 通 过 D owex- 1 离子交换柱除去 I O r 及未反应的 I O r ， 纯化聚醛。再用二次去离子水4°C 透 析（纤维素透析管，截留分子质量 3500) 3d 。
4 . 冻干纯化后的聚醛衍生物。产物为白色粉末。
平均产率为 7 0 % 。 FT-IR (KBr) 在 1724 cm-1 观察到 C= O 吸收峰。
5.通过羟氨盐酸盐滴定测定聚醛含量（Z h a o and Heindel 1991)。
寡胺键合
6•将氧化后的葡聚糖（l g ， 0.75〜6. 56m m o l 醛基）溶 于 I O O m l 二次去离子水中。将其缓慢滴加到 50m l 含 有 5 0 % 过量精胺的硼酸盐缓冲溶液中。
7 . 室温下搅拌 2 4 h 。 加 人 N a B H 4 (l g ， 4 倍醛基摩尔数），将亚胺还原成 胺 。 继续搅拌 48 h 。
8•另用 N a B H 4 (l g ， 4 倍醛基摩尔数），反 应 24 h , 重复还原。
9•将亮黄色溶液转移到透析管中（纤维素透析管，截留分子质量 3500)，用二次去离子水 4°C 透 析 3d 。
1 〇•冻干透析产物，氮气条件下储存。平均产率为 5 0% (OT/m )。通过对产物的核磁共振分析得到产物的氨基比例。（m ) 多重峰，（H ) 质子氢。
细胞数除以视野内的总细胞数计算转染效率（转染百分比)。
在有些情况下，基因表达可以用标准 BCA 试剂盒检测蛋白总量，对结果归一化
