可复制和复制缺陷型 H SV 载体的构建

材料

试剂

细胞：标 准 V ero 非洲青猴肾细胞的 7b 变 种（ Marconi e t 吐 1996)， Ver0 细胞(ATCC: CCL81)，或其他辅助细胞系

这些细胞是 HSV-I 可复制或复制缺陷型病毒增殖所需的。

结晶紫溶液（1 % 溶解于甲醇： d H 2 〇, 50 : 50, V A O

DMEM/10% 胎 牛 血 清（FBS)

补充了非必需氨基酸的 D M E M 培养基

100 U / m l 青霉素 G

lOOug/ml 硫酸链霉素

2m m o l / L 谷氨酰胺

10% F B S

乙 醇（70%)

甘油

H E P E S (l m o l/L , p H 7. 35)

碘 克 沙 醇（60%; Invitrogen)

使用前，将 6 0 % 的碘克沙醇用 PBS 稀释至最终浓度为 2 0 % 。

异丙醇

Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

裂解缓冲液（l 〇〇 mmol/L Tris-HCl pH 8. 0 和 lOmmol/L EDTA)

甲基纤维素覆盖（I. 〇%)

在附有搅拌棍的500m l消毒瓶中，将 25ug甲 基 纤 维 素 加 人 IOOml pH 7. 5 的 PBS溶液中，在 液 流 中 对 瓶 子 进 行 高 压 处 理（45 min)。溶 液 冷 却 后 ，加 人 350m l含 有 非 必 需 氨 基 酸 、lOOU/m l青 霉 素 G、 lOO^g/m l硫酸链霉素和2 mmol/L 谷 氨 酰 胺 的 DMEM。充分混匀，将瓶子放在搅拌器上4°C过夜。当甲基纤维素溶解后，加 人 50 ml FBS。

PacI限制性内切核酸酶（New England BioLabs)

PBS CpH 7. 5)

135 mmol/L NaCl

2.5 mmol/L K C l

I.5 mmol/L KH2P0 4

8.Ommol/L Na2 HP 〇 4

质粒

转染质粒 p l i u i (Krisky et al.1997)

含有兴趣基因的质粒

蛋白酶 K (BoehringerMannheim)
Tris 盐 缓 冲 液（TBS) (pH 7. 5) [50 mmol/L Tris-HCl (pH 7. 5) , 150 mmol/L

NaCl 和 lmmol/L EDTA

TE [lOmmol/L Tris-HCl (pH 8. 0 ) 和 lmmol/L EDTA

T E 平衡的苯酚：氯 仿 ：异 戊 醇（25 : 24 : 1， V /V /V )

病毒： T0 Z.1 病 毒（K riskyetal.1997， 1998b)

X-gal 显色溶液

300ug X-gal/ml TBS

14 mmol/L K4Fe(CN)6O

14 mmol/L K3Fe(CN)6

X-gal 难溶于水，必须先溶解于二甲基甲酰胺 , 然后再加人显色溶液中。
仪器

细胞刮刀

离 心 瓶（500m l 聚丙條)

C O 2 培养箱

Cup-horn 超声波破碎仪

保 温 瓶（T-75 cm2)

排枪

Nutator 旋转台

Phase L o c k Gel H e a v y 管（Eppendorf)

培 养 板（6 孔、 12 孔 和 96 孔板）

带 J L A 10. 5 转头的预备式离心机（Beckman)

滚 瓶（850 cm2)

带针头的注射器（3m l )

管子：

13 ml B e c k m a n 17m m path-length seal

15ml锥形瓶

带 N V T 65 转头的超速离心机（B e c k m a n X L -90)

宽口枪头

方法

1•将 2.4X 10⁷pfu 的 TOZ.1 病毒加入到约 8 X 10⁶ 个 辅 助 7b 细 胞 中（感染复数= 3)。
37°C 旋转培养 lh 。

2 . 将感染的细胞转入 T - 7 5 瓶中。在 37 °C CO2 培养箱中培养 18〜24 h。

所有的细胞都应被病毒感染，并吸附在瓶上。

3.用细胞刮刮下细胞。转 人 15m l 的锥形管中

4.4 ° C ， 2 0 6 0 g 离 心 l Omin。除去上清。

5•将 I m l 加有 0. l m g / m l 蛋白酶 K 的裂解缓冲液加入到管中。

6 . 将管子置于 N u ta to r 旋转台上， 37° C 旋转过夜。

7•将溶液转人 P h ase L ock G el H eavy 管。

8•加人 Im l 的苯酚：氯 仿 ：异 戊 醇（25 : 24 : 1)。轻轻混匀 1〜2 min。

9.3020 g■离心 5m i n 。

10.将水相转到新管子中。

11.加 入 2 倍体积异丙醇。充分混匀。

12.用玻璃枪头将沉淀的 DNA (白色絮状）绕在上面。

1 3 . 将缭绕的 D N A 转到新管子中。用 7 0 % 乙醇清洗。让 D N A 在空气中风干。

14.在干燥的管中加人 0.5 ml T E 缓冲液。 25°C 孵育过夜。

15.用宽口枪头轻轻吹打，使 DNA 重悬。

用 宽 口 枪 头（Gilson) 能最大限度减少病毒 DNA 的断裂，从而提高病毒 DNA 的感染力。

16•用分光光度计测定 D N A 浓 度（OD260)。

17•将兴趣基因克隆到 U L 41 穿梭质粒中。

18•转染前一天，将 5X 10⁵ 个 7b 细胞种到含有 D M E M /10% F B S 的 6 孔板中。

19.根据制造商的方法， 37°C 下 ，用 P a c I 酶切病毒 D N A (由步骤 15 得到）6 h 。

20•根据制造商的方法，用 Lipofectamine 2 0 0 0 将病毒 D N A 和质粒 D N A 转入细胞。

质粒载体在转染前应线性化，与未经酶切的超螺旋质粒相比，能提高重组的效率。对质粒进行酶切，将插入片段释放出来，并纯化限制性酶切片段，并不能提高重组效率。然而，推荐使用纯化的片段，因为这减少了由于半同源重组将质粒载体序列插人病毒中的可能性。

2 1 . 加 入 新 鲜 的 D M EM / 1 0 % F B S ， 37°C 培 养 。
根据不同的病毒，在 3〜5d 内形成菌斑。

22•形成菌斑后，收获培养基和细胞。

23•将细胞反复 冻 融 3 次 。超 声 波 破 碎 细胞。

24.4°C ， 2060 g 离 心 5m i n 以除去细胞碎片。将上清与从以前得到的培养基（步 骤 22)混合。

将上清于一 80°C 保存放置。

25.确定储存的重组病毒的滴度。

a•用无血清的培养基将病毒进行一系列的 1 〇倍稀释（ICT2〜1 〇_1°)。

b•将每个稀释倍数的病毒加 l 〇〇 Ml 到含有 4X10⁵个 7 b 细胞/孔 的 12 孔板中。

c. 37°C 下，将平板在 C O 2 培养箱中孵育 l h 。加 入 I m l 的 D M E M / 1 0 % F B S ，培养箱中过夜。

d•接下来的 24 h 内，除去培养基。在单层细胞上覆盖 I m l 的 1 % 甲基纤维素/10%F B S 溶液。 ，

e•将平板孵育 3〜5d 直到形成菌斑。

f. 拿出甲基纤维基膜，用结晶紫溶液染色 5m i n 。

g•进行斑点计数并计算原来的 pfu/l m l 的数量。

26•将 30 p f u 的病毒加入置于 I5m I 锥形管中的个数约为 2X 10⁶ 的 I m l 悬浮细胞中。

37° C 下 ，将管子放置于 Nutator 旋转台上 I.5 h。

27•加入 9m l 的新鲜培养基。在 96 孔板每孔接种 100ul。

28.37°C 下 ，将平板在 C O 2 培养箱中孵育 3〜5d ，直到形成菌斑。

29•用 X -gal 染色来确定哪些样品含有所需的重组病毒所形成的菌斑。
如果发生了重组，兴趣基因会替换报道基因。

a. 将培养基从 96 孔板转移到新的卯孔板中。

将这块平板在一 80°C 保存，以备下一轮限制性稀释所用。

b•在有转染细胞的 96 孔板中，每个孔加入 100/J 的 X -gal 染色溶液。

c.将平板在 37°C 培 养 1〜18 h ，直到形成蓝色斑块。

d. 确定只含有一个白色斑块的孔。

如果病毒重组体中的兴趣基因取代了 T O Z .1 中的 ZacZ, 就会形成白色斑块。

3 〇•用保存在一 80° C 的病毒再进行两轮限制性稀释斑点分离（步 骤 26〜29)。

3 1 . 分离病 毒 D N A , 用 Southern 印迹确定存在插入基因和缺失被删除基因（步骤29a) 。

在这一步，保存的病毒可以用来制备一般实验所需的高滴度储存液。
病毒储存液的制备和纯化下列步骤是用两个滚瓶的细胞准备的病毒储存液。请根据需要调整规模。

32.在两个 850c m 2 滚瓶中，每个加人 I O O m l 含 约 2 X I O ⁷ 个辅助细胞的 D M E M /10%

F B S 培养基。 37°C 孵育。

如果不在 CO2 培养箱中孵育，就在每个瓶中加人 1.7 ml 的 HEPES (pH 7.35) 来对培养基

进行缓冲。

33.当细胞单层达到大约 7 5 % 汇 合 度 时（2〜3d)，吸去培养基。加 入 I O m l 含感染倍数为 0. 02〜0. 05 病毒的无血清 D M E M 。在 37°C 孵 育 I.5 h 。

34.在吸收阶段的末期，加入 90m l 含 有 Iml H E P E S 的 D M E M /10% F B S 。在 37°C 孵育2〜3d 。

用光学显微镜观察瓶子，确定收获病毒的最优时间。时间根据不同的病毒骨架而变化 。 一般来说，当大部分细胞发生卷曲，但还未从瓶子表面脱落时，病毒的细胞毒性就很明显了。

35.用细胞刮刀将细胞刮人培养基。

36•收获含有悬浮细胞的培养基。 4°C ， 2060 g 离 心 lOmin。

37•将上清移到 500m l 聚丙烯离心瓶中。冰上放置。

38.用最少体积（2〜5m l ) 的无血清 D M E D 重悬细胞。用三轮超声波破碎来释放细胞相关病毒。

39.4°C ， 2060 g 离 心 l Omin。移出上清。与步骤 3 7 中所得的上清混合。冰上放置。

40•用带 J L A 10. 5 转头的 B e c k m a n 预备式离心机，将混合上清 18 600 g 离 心 l h。

41.弃上清。每个含有病毒感染细胞的滚瓶中加人 500ulPBS，充分振荡使病毒重悬。

42.将上清转移到 13 ml B e c k m a n 1 7 _ path-length 封闭管中。加 2 0 % 碘克沙醇直到总体积为 13m l 。封闭管子。

43.用 带 N V T 65 转头的 B e c k m a n X L -90 超速离心机， 342 000 g尽离心 4.5h。

44.用 3m l 注射器的针头插人封闭管，吸出 1〜1.5m l 的 病 毒（上部）带（图 2)。

几乎 60% 的病毒都会出现在从梯度底部起的第二条带上。有时用野生型制备时，可能会出现一条较高的缺陷性带。如果有三条带，取中间的一条。另外，可对管子进行分馏并确定确定每个馏分的滴度

45•整数倍稀释病毒并测定滴度。一 80°C 保存病毒。 Optiprep 可被用作防冻剂。3〜5 的低感染复数就足够转导 100% 的细胞，而不像其他病毒，如腺病毒、 AAV、标准逆转录病毒和慢病毒。可通过不同剂量的直接注射将病毒转导至体内。