共聚焦显微镜激光扫描法
实验原理
由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
实验材料
仪器/耗材
实验步骤
一、观察及仪器操作
1. 开启仪器电源及光源
一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。
一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。
2. 设置相应的扫描方式
在目视模式下，调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。
在目视模式下，调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。
3. 获取图像
选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。
选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。
4. 关闭仪器
仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统。则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统。则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
二、获取三维图像
激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。选用“Z-Stack"模式，即可实现此项功能。
激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。选用“Z-Stack"模式，即可实现此项功能。
1. 开启“Z-Stack”选项。
2. 确定光学切片的位置及层数。
3. 启动“Start”，获得三维图像。
三、获取时间序列图像
共聚焦显微镜的"Time-Series"功能，可以自动在实验者规定的时间内按照设定的时间间隔获取图像。只需设定所需的时间间隔以及所需图像数量，开启“Start T”功能键，即可进行实验。“Time-Series”功能大大减轻了实验者的劳动强度，对于荧光漂白恢复和钙离子成像等实验非常实用。
共聚焦显微镜的"Time-Series"功能，可以自动在实验者规定的时间内按照设定的时间间隔获取图像。只需设定所需的时间间隔以及所需图像数量，开启“Start T”功能键，即可进行实验。“Time-Series”功能大大减轻了实验者的劳动强度，对于荧光漂白恢复和钙离子成像等实验非常实用。
注意事项
1. 仪器周围要远离电磁辐射源；
2. 环境无震动，无强烈的空气扰动；
3. 室内具有遮光系统，保证荧光样品不会被外源光漂白；
4. 环境清洁；
5. 控制工作温度在5～25℃。
