制备慢病毒载体
实验原理
制备慢病毒载体
材料
试剂
CaCl2 (2mol/L)
Dulbecco’s modified Eagle’s 培 养 基（DMEM) 包 含 4. 5 g/L 葡 萄 糖（无血清完全)和 1 0 % 胎 牛 血 清（FCS)
2 X HBS ( HEPES-buffered saline)
50 mmol/L HEPES
280 mmol/L NaCl
I. 5 mmol/L Na2 HP 〇 4
用 5mol/L NaOH 调 pH 到 7 .12。
HEK 293 T 细 胞（ATCC， CRL 11268)
磷酸盐缓冲液 P B S
质粒
DAF 编码的转基因质粒
包膜编码质粒（env)
Gp64-DAF 融合蛋白编码的转基因质粒
包 裹 质 粒（pack)
转基因质粒（trans)
VSV-ODAF 融合蛋白编码转基因质粒
0.IX T E
10 mmol/L Tris-HCl ( p H 8.0)
lmmol/L EDTA ( p H 8. 0)
双 蒸 水 WdH20 ) 稀 释 I : 10。
仪器
Beckman转子， SW28或相当
滤 膜（〇 .45 um ， 500 ml)
孵育， 30°C或 37°C
SW 28 Ultra-Clear Beckman 管
组织培养板（I O c m )
方法
1 转染前一天， IOcm培养板DMEM培养基接种293T细 胞 10% 汇合。转染当天，细胞 40%〜70% 汇合。
2.转染前2 h ，更换新鲜的DMEM培养基。
3.根据试验需要，按 比 例（表 1、表 2 ) 混 合 e n v、 pack、 t a n s质粒和编码D A F 或融和蛋白 g p 6 4 -D A F 或 V S V - G - D A F 质粒。
4•加 125ul 2m o l / L CaCl2* 2〇 ul 〇 • I X T E 到质粒混合物中，加 d d H 20 总体积到 l m l 。
5.逐滴加 I m l 的 D N A 混合物到I m l 的 2 X H B S 中，最大速度振荡，静 置 30 min。
6•慢速逐滴加沉淀到细胞。
7.孵 育 16 h。
通过共展示gp64-DAF或 VSV-ODA F融和蛋白产生的DAF修饰的gp64或 VSV-O 假型源于 H I V - I 的慢病毒载体，孵 育 3〇°C替代标准的37° C 。
8 . 去掉培养基，用 10〜12m l新鲜的完全培养基替代。病毒收集，过滤，浓缩
9.转染后 48 h ，收集培养基，细胞板加入新鲜的1 〇〜12m l 培养基。
10.0.45um滤膜过滤收集的培养基。一80°C保存过液。
11.每天重复步骤8〜9 (第一次收集V S V -G 假型病毒后2〜3d ，收集 gP 64假型病毒后4〜6d)。
因为VSV-G 细胞毒性，很少产生VSV-G 假型质粒细胞存活超过4d, 相 比 gP64低毒性可以在转染gp64后一周细胞存活收集培养基。
12.汇合收集的培养基。 Ultra-clear管（最大30m l/管）S W 28转子， 4°C ， 25 000r/m i n 离心 2 h 。
13.去处上层液体，完全 D M E M 培养基重悬沉淀。 一 80°C 保存重悬质粒，供进一步分析使用。
体外血清失活分析
材料
试剂
细胞，指数生长的293 或 H T 1080 (人纤维肉瘤）
D M E M 培 养 基（完全的和无血清的）包 含 1 0 % 胎牛血清
人血清补体（C H M > 1 0 0 ; 正常的和热失活的）
失活补体， 56°C 孵育lh。
Polybrene (聚凝胺）
假 型 H I V -I 源的慢病毒载体（>1〇7 转染单位/m l )
应该构建编码绿色荧光蛋白的质粒。
仪器
水 浴 锅37°C 和 56℃
振荡混合器
方法
1•用等量的人正常血清补体稀释 100ul 载体。用热失活人血清或完全D M E M 培养基作为对照。
2•孵育载体补体混合物 37°C 、 l h 。每 15m i n 振 荡 2s。
3•孵育之后用无血清 D M E M 稀释反应液 10 倍 。
4 . 在存在 8 哗/1111 的 Polybrene 的条件下，系列稀释含有编码 G FP 的病毒载体，感染H T 1080 或 293 细胞。
5.转导后48 h ，在含有最高稀释病毒载体的培养板上进行 G FP 阳性计数。
6.计算病毒滴定量（阳性表达作为 G F P 转导单位/m l ; G F P -T U /m l ):
病毒滴定量= ( G F P 聚焦数 X 稀释因子）/用于转导的载体的体积
实验步骤
制备慢病毒载体
材料
试剂
CaCl2 (2mol/L)
Dulbecco’s modified Eagle’s 培 养 基（DMEM) 包 含 4. 5 g/L 葡 萄 糖（无血清完全)和 1 0 % 胎 牛 血 清（FCS)
2 X HBS ( HEPES-buffered saline)
50 mmol/L HEPES
280 mmol/L NaCl
I. 5 mmol/L Na2 HP 〇 4
用 5mol/L NaOH 调 pH 到 7 .12。
HEK 293 T 细 胞（ATCC， CRL 11268)
磷酸盐缓冲液 P B S
质粒
DAF 编码的转基因质粒
包膜编码质粒（env)
Gp64-DAF 融合蛋白编码的转基因质粒
包 裹 质 粒（pack)
转基因质粒（trans)
VSV-ODAF 融合蛋白编码转基因质粒
0.IX T E
10 mmol/L Tris-HCl ( p H 8.0)
lmmol/L EDTA ( p H 8. 0)
双 蒸 水 WdH20 ) 稀 释 I : 10。
仪器
Beckman转子， SW28或相当
滤 膜（〇 .45 um ， 500 ml)
孵育， 30°C或 37°C
SW 28 Ultra-Clear Beckman 管
组织培养板（I O c m )
方法
1 转染前一天， IOcm培养板DMEM培养基接种293T细 胞 10% 汇合。转染当天，细胞 40%〜70% 汇合。
2.转染前2 h ，更换新鲜的DMEM培养基。
3.根据试验需要，按 比 例（表 1、表 2 ) 混 合 e n v、 pack、 t a n s质粒和编码D A F 或融和蛋白 g p 6 4 -D A F 或 V S V - G - D A F 质粒。
4•加 125ul 2m o l / L CaCl2* 2〇 ul 〇 • I X T E 到质粒混合物中，加 d d H 20 总体积到 l m l 。
5.逐滴加 I m l 的 D N A 混合物到I m l 的 2 X H B S 中，最大速度振荡，静 置 30 min。
6•慢速逐滴加沉淀到细胞。
7.孵 育 16 h。
通过共展示gp64-DAF或 VSV-ODA F融和蛋白产生的DAF修饰的gp64或 VSV-O 假型源于 H I V - I 的慢病毒载体，孵 育 3〇°C替代标准的37° C 。
8 . 去掉培养基，用 10〜12m l新鲜的完全培养基替代。病毒收集，过滤，浓缩
9.转染后 48 h ，收集培养基，细胞板加入新鲜的1 〇〜12m l 培养基。
10.0.45um滤膜过滤收集的培养基。一80°C保存过液。
11.每天重复步骤8〜9 (第一次收集V S V -G 假型病毒后2〜3d ，收集 gP 64假型病毒后4〜6d)。
因为VSV-G 细胞毒性，很少产生VSV-G 假型质粒细胞存活超过4d, 相 比 gP64低毒性可以在转染gp64后一周细胞存活收集培养基。
12.汇合收集的培养基。 Ultra-clear管（最大30m l/管）S W 28转子， 4°C ， 25 000r/m i n 离心 2 h 。
13.去处上层液体，完全 D M E M 培养基重悬沉淀。 一 80°C 保存重悬质粒，供进一步分析使用。
体外血清失活分析
材料
试剂
细胞，指数生长的293 或 H T 1080 (人纤维肉瘤）
D M E M 培 养 基（完全的和无血清的）包 含 1 0 % 胎牛血清
人血清补体（C H M > 1 0 0 ; 正常的和热失活的）
失活补体， 56°C 孵育lh。
Polybrene (聚凝胺）
假 型 H I V -I 源的慢病毒载体（>1〇7 转染单位/m l )
应该构建编码绿色荧光蛋白的质粒。
仪器
水 浴 锅37°C 和 56℃
振荡混合器
方法
1•用等量的人正常血清补体稀释 100ul 载体。用热失活人血清或完全D M E M 培养基作为对照。
2•孵育载体补体混合物 37°C 、 l h 。每 15m i n 振 荡 2s。
3•孵育之后用无血清 D M E M 稀释反应液 10 倍 。
4 . 在存在 8 哗/1111 的 Polybrene 的条件下，系列稀释含有编码 G FP 的病毒载体，感染H T 1080 或 293 细胞。
5.转导后48 h ，在含有最高稀释病毒载体的培养板上进行 G FP 阳性计数。
6.计算病毒滴定量（阳性表达作为 G F P 转导单位/m l ; G F P -T U /m l ):
病毒滴定量= ( G F P 聚焦数 X 稀释因子）/用于转导的载体的体积
