实验方法

RNA干扰（转录后基因沉默）实验

难度系数: 4.3

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RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。目前主要用于（1）特异性剔除或关闭特定基因的表达 （2）探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗 （3）使用RNAi技术来病毒进入人体细胞

RNA干扰

实验原理

1. 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应。其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21-23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。


2. RNAi具有的特征


①RNAi是转录后水平的基因沉默机制；


②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；


③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；


④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；


⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；


⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。


3. 也有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。

实验材料

mRNA

试剂/试剂盒

shRNA试剂盒 siRNA试剂盒 Dicer酶 载体 病毒

仪器/耗材

培养皿 RT-PCR仪、Real-time PCR仪

注意事项

1. 可以通过标记siRNA来优化实验：荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
2. siRNA的设计方法多样，需要根据自己的实验情况认真选择，且阳性对照和阴性对照组需要齐全。

其他

提高siRNA和表达载体转染效率的方法：


1. siRNA必须纯化：在转染前要确认siRNA的大小和纯度，为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过l5%-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸、小的寡核苷酸、蛋白质和盐离子。尤其是化学合成的RNA通常需要PAGE胶纯化。


2. 避免RNA酶污染：即使微量的RNA酶也会导致实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。


3. 健康的细胞培养物和严格的操作：通常健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。


4. 通过合适的阳性对照优化转染和检测条件：将不同浓度阳性对照的siRNA转入靶细胞，转染48h后统计对照蛋白质或mRNA相对于未转染细胞的降低水平，过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

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