材料

试剂
Advantage GC-2 聚合酶混合液（BD)

2XBES 缓 冲 血 清（B B S ) 溶 液（50 mmol/LBES， 280 mmol/LNaCl， I. 5 mmol/L Na2 HPO4

混合 16. 3 g NaCl、 10. 65 g BES (Calbiochem 3 9 1 3 3 4 ) 和 0. 2Ig Na2 HPO4。添加双 蒸 水 至900 ml。溶 解 ，用 lm ol/L N aO H 调 节 p H 至 6. 9 5 , 添 加 双 蒸 水 至 终 体 积 I U 过 滤 除 菌 ，16m l分 装 后 保 存 于 4°C 。

CaCl2 (2. 5 m o l/L )储备液

细胞： 293T 人类胚胎肾细胞（Invitrogen)

二 甲 亚 砜（dimethylsulfoxide) (DMSO; 7%)

DMEM 培养基

ELISA 试剂盒， p24 (New England Nuclear Life Science product NEK050B) (可选 ：见步骤 15)

胎 牛 血 清（FBS)

Hank 平衡盐溶液（HBSS; Invitrogen)

克隆到 pGEM -T 中的 H l 启 动 子（Promega)

质粒

pMDL (Gag-Pol)

pREV

pVSV-G

对 于 质 粒 制 备 ，使用 I ug/fxl 的 QIAGEN plasmid maxipreps。

多聚赖氨酸（Poly-L-lysine) (Sigma-Aldrich P 4832)

溶 于 PBS，终 浓 度 0. 0 0 1 % 。过滤除菌保存于一 20°C 。

限制性内切核酸酶： NheI、 Ssph、XbaI

蔗 糖（20% 溶 于 HBSS)

设备

Beckman 管（358126 和 326819)

过 滤 器（0. 22um 或 0. 45um)

培养箱，预 设 37°C (3% 和 10%CO2)

离心管

PCR 仪

Sw58 和 Sw55 离 心 机（Beckman)

细胞培养皿（15 cm， 6 孔板）

方法

shR N A 的设计和克隆

1 . 在基因中选择一段靶标序列来沉默，如对于 GFP: GCAAGCTGACCCTGAAGTTC

慢病毒质粒中。 消化插入片段，琼脂糖凝胶电泳纯化。 M ieI 消化慢 病毒质粒，电泳纯化，然后去磷酸化。 一 般 5〇n g 载 体 连 接 IOOng插 人 片 段 ，转 化 感 受 态 细 菌 。可 以 通 过 S^ I 酶 切 筛 选 连 接 转 化 成 功 的 菌 落 ，原 载 体 只 含 有 一 个 S5/>I 位 点 ，而 插 人 目 的 片 段 的 载 体 会 获 得 另 外 一 个 S ^ I 位 点 （ 位 于 H l 启 动 子 ） 。使 用 H l-F 引 物 5'-T G G C A G G A A G A T G G C T G T G A l并 测 序 来 确认发 夹 结 构 也 是 非 常 重 要 的 。因为发夹序列中的突 变 会 显 著 降 低 基 因 沉 默 的 效 率 。 5. 通过转染或转导（ 慢病毒颗粒）到表达靶标基因的细胞来鉴定克隆的shRNA沉默 盒。另外还可以在易于转染的细胞系（ 如 293T ) 中加入与shRNA沉默盒共表达的 靶基因cDNA。 当 靶 标 m R N A 只 在 特 定 细 胞 中 存 在 或 没 有 靶 标 的 特 异 性 抗 体 时 ，这 种 方 法 特 别 有 用 。 一 般 ，我 们 在 每 个 孔 中 （6 孔 板 ）加 人 200n g 靶 标 cD N A 和 500〜 IOOOng包 含 沉 默 盒 的 质 粒 进 行 转 染 。转 染 后 48〜72h 收 集 细 胞 进 行 免 疫 印 迹 分 析 。 慢病毒载体制备 6. 准 备 12cmX15cm平皿慢病毒：转染前24h，准备平皿和细胞。 a. IOml聚赖氨酸附着12cmX15cm平皿，室温培养15min，吸除液体，以增加细 胞黏着力。 b. 立即从两个细胞汇合的15cm平皿中接种细胞到12cmX 15cm平 皿 （ DMEM+ 1 0 % FBS)。加 入 1 % 抗生素-抗菌素溶液不影响转染。细胞传代次数不宜过多， 超 过 20次的就不要用了，否则生长很慢。某些品牌的FBS不支持有效转染，会 引起病毒滴度过低。 • 2" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470016811381dbur2si9ybpng_small.jpg" style="width: 489px; height: 703px;" />