基 本 方案 离 人 肠 黏 膜 单 个 核 细 胞

材 料

新鲜的大肠或小肠样本，外科手术后分离获得

H B S S ，不含钙和镁， p H 7. 2

D T T - H B S S 溶液： 75m g D T T 溶于 50 ml H B S S ，新鲜配制

E D T A - H B S S 溶液

消化酶溶液，新鲜配制

R P M I -IO 完全培养基

VFicoll 分离液，密 度 为 L 076〜1.078 g/ml

30 % Percoll 溶液

一 次 性 250m l 有旋盖平底塑料容器、弯头镊和弯头眼科剪

I O O m m 和 50m m 塑料培养皿

5c m 磁性搅拌子，有菌或无菌

磁性搅拌器，室 温 和 37°C

光学显微镜

250 ml —次性带旋盖的埃伦迈尔烧瓶，无菌

外科无菌手套

I O c m 无菌玻璃漏斗

50m l 无菌锥形底离心管

聚 苯 乙 烯 环（5c m 直径， I c m 高度）

Nitex滤 网（1 0 0 目； Tetko) ，剪 成 I O c m 方形大小

1 . 用冷的自来水彻底冲洗外科分离的大肠或小肠样品，以除去血和管腔内容物，沿管腔垂直剪开，肉眼观察黏膜。根据临床诊断、解剖定位、大小及形态学特征，切取合适的区域[来自乙状结肠切除术或者回肠切除术的样本，平 均 大 小 为（2〜3) c m X(2〜10)c m ，重 量 约 10 g]。如果获得的组织块过大，则将其切为大小均一的样本，分别处理。

2 . 将切除的组织浸于100 ml H B S S 溶液中，放置在一次性250m l 平底塑料容器内，迅速转移至实验室。

3 . 用 IOOml新 鲜 的 H B S S 溶液冲洗样本，去除坏死组织和粪便。轻轻吸干黏膜表面水分 ，去除过多的黏液。再 用 H B S S 清洗样本一遍。

4 . 将组织平铺于纸上，黏膜面朝上。从样本的边缘用弯头镊轻轻地夹起黏膜。从提起的样本边缘开始用弯头剪剪开黏膜和肌肉层。如果可能，在环状褶的位置垂直切去肌肉，得 到 5m m 长和宽的样本。肉眼检查样本以了解肌肉是否被完全清除。把黏膜片放到含有100m m H B S S 的培养皿中。

5 . 在含有新鲜H B S S 的培养皿中彻底清洗黏膜片，清 洗 后 将 其 移 入 含 有 50 ml D T T /H B S S 的 250m l 平底塑料容器内，旋上盖子。将容器置于搅拌器上， 60r/m i n 室温搅拌 30m i n 以松解残余的黏膜和碎片（溶液会逐渐变为轻度混浊，并含有一些小的漂浮碎片）。

6 . 取出黏膜碎片和搅拌子，放入含 有 新 鲜 H B S S 的培养皿中清洗，并转移至另一含有100m l E D T A /H B S S 的容器中。室 温 搅 拌 90 min，让溶液中的组织剧烈振动，使上皮细胞从基底膜脱落。

7 . 根据情况，重复搅拌一次或两次，直到上皮细胞基本脱落。若在搅拌过程中溶液变得非常混浊，应及时更换。

8 . 将黏膜片和搅拌子移至一含有100 ml H B S S 的新的容器中。 30m i n 更 换 一 次 H B S S逐步清洗黏膜片直到洗液变得澄清（一 般 洗 2〜6 次）。有些重度炎症组织样本可能出现一些不确定的情况，需要区分预期的脱落上皮细胞、继续脱落的细胞及碎片，以避免搅拌过度导致上皮细胞的丢失。若出现可疑物质，用显微镜仔细检查漂浮的物质。

9 . 在 无菌的含有5m l 消化酶溶液的50m m 的培养皿中用眼科剪剪碎黏膜片至 5m m 大小 。将平皿内的物质全部倒入无菌的含有IOOml消化酶溶液和磁性搅拌子的250 ml埃伦迈尔烧瓶中。若黏膜片很大，用两个或更多的埃伦迈尔烧瓶。旋松瓶盖，置于磁性搅拌器上， 37°C ， 60r/m i n 搅拌> 8 h 。

1 0 . 戴上外科手套，将 IO cm 直径的玻璃漏斗架于 50m l 锥形离心管上。在聚苯乙烯环下放 置 IOcm2 的 N ite x 滤网，使其牢固。若 步 骤 9 中用两个烧瓶，则需要两套独立的过滤设备。

1 1 . 视上清的颜色和气味检查埃伦迈尔烧瓶中是否有细菌污染，若显微镜证实有污染则应重新制备样品。

1 2. 将埃伦迈尔烧瓶 450 角 倾 斜 30s 使组织碎片沉淀。将上清缓慢倒入滤器上。避免将组织倒入滤器以免堵塞。必要时可以更换离心管。若液体稠厚或含有过多碎片可以重 复 过 滤（反复炎症肠黏膜取出大块样本时可见）。

1 3 . 室温， 400 g 迅速离心，弃上清。用 RPMI-10 完 全 培 养 基 重 悬 所 有 沉 淀 物（包括步骤 1 和 步 骤 9 获得的样品）。沉淀物往往较大而且由于红细胞污染会带有淡红色。

14.计 数 细 胞（附 录 3A )，并用台盼蓝拒染法了解细胞的活力（附 录 3C )。注意细胞的密度、死细胞的比例、可能污染的上皮细胞及细胞团块的存在与否。若活细胞比例< 5 0 % 或存 在 许 多 团 块（炎症样本可能出现），用 尼 龙 柱 过 滤（见辅助方案）。

1 5 . 将细胞悬液分成几个等份分别置于50m l离 心 管 中（每 份 都 需 用 Ficoll密度液进行分离，样品若有6 0 % 〜7 0 % 的细胞活性需要用4〜8 份梯度液进行分离），每一份都用 25m l的 HBSS稀释。

16 . 缓慢加入12m l 的 Flcoll密 度 液（避免破坏液面），盖紧盖子，室温， 2100 g 离心 5 min。

1 7 . 丢弃最上层的物质。液面交界处有一层细胞，白色松散状，比 P B M C 分离后更宽且分界不明显，用 5m l 移液管小心吸取交界层细胞加入新的50m l 离心管，每两个梯度用一管。避免吸人下层的Ficoll密度液和管壁上细胞团块。

1 8 . 在离心管中加满H B S S ，盖 紧 盖 子 ，翻转混匀，室温 ， 400 g 离 心 5 min，弃上清。将所有沉淀物移入一个离心管内，重复离心。用 5〜IOml R P M I -I O 完全培养基重悬沉淀物。计数细胞，并用台盼蓝拒染法了解细胞的活力。

19.可选：若最终的细胞悬液中含有> 2 0 % 的死细胞，表 示 Ficoll 分离液用量不足，或者分离前需用尼龙柱预过滤。为了获得更多的活细胞，可以将细胞分成几等份并加于 2〜4 倍 体 积 的 Percoll 上（单 元 2. 5)，离心。对每份而言，在 50m l 离心管内，
将 51111 细胞悬液加于 201111 3 0 % 的 ？ 61*〇〇 11 上，室温， 400^’离心 20111 丨 11。取底部沉淀
的活细胞。
2 0 . 立即使用细胞，或 用 R PMI-IO完全培养基重悬细胞， 4°C 暂时存放细胞（不能过夜）。

辅 助 方 案 用 尼 龙 毛 过 滤 器 去 除 死 细 胞

附 加 材 料（其他材料见基本方案，带 V 项 目 见 附 录 1)

3 通管

20m l 尼龙毛柱

1 . 过 滤 前（见基本方案，步 骤 1 4 ) 将细胞转移至50m l 离 心 管 中（< 2 X 10⁸ 个细胞/柱）。加 满 H B S S 重复颠倒混匀。去除大的细胞团块以防止过多细胞黏着从而堵塞尼龙柱。

2 . 将 20m l 尼龙毛柱连于 3 通管并固定于直立的环架上。柱下接一 新 的 50m l 离心管收集细胞。

3 . 打 开 3 通管让细胞悬液有序进入尼龙柱，用 H B S S 洗柱子，若收集细胞的离心管已满可以更换，直到收集总体积达 100m l 。应保持尼龙毛基质完全湿润。若流速很慢，用无菌 Pasteur 吸管搅拌柱的顶部（避免重悬整个柱内基质）。

4 . 室温， 400 貧离心5 min。弃上清，用 H B S S 重悬沉淀物。调节体积以进行 Ficoll分离(见基本方案，步 骤 15)。