基 本 方案

材 料

外周 血 单 个 核 细 胞（P B M C ; 单 元 8.1)

RPMI- 5 和 RPMI-IO 完全培养基

P W M 溶液
9 6 孔 平 底 培 养 板（Costar)

1 . 计 数 PBMC (附录 3A ) ， 用 RPMI-5 完全培养基调整浓度至 4 X 10⁷ 个细胞/2m l 。室温 ， 400 g 离 心 IOmin，弃上清。加 入 RPMI- 5 完全培养基，重复洗涤至少 4 次 。

2 . 再次计数 P B M C ，用 R P M I -I O 完全培养基调整浓度至 5X I O ⁵ 个细胞/ml。在 9 6 孔板中加入 0.2m l 细 胞 悬 液（每 孔 I X I O ⁵ 个细胞）。各实验组设 2 复孔。避免使用培养板四周边缘的孔。细胞培养时间较长时，周边孔中应加满水以减少实验孔的液体挥发。

3 . 加 入 20ul PWM (最终稀释度 1 : 1 0 0 ) 诱 导 PBM C 活化。本底对照组不加刺激。细胞置 于 37°C ， 5 % C 0 2 细胞培养箱中培养（E L I S P O T 检 测 ，一 般 需 培 养 7d ; ELISA检测上清，需 IOd)。

4 . 收集细胞进行后续反向空斑实验（单 元 7. 13)、 E L I S P O T 检 测（单 元 8. 1 1 ) 或收集培养上清进行 E L I S A 检 测（单 元 8. 12)。