流 式 细 胞 仪 检 测 全 血 的 人 淋 巴 细 胞
实验原理
基本方案
材 料（打 V 项 目 见 附 录 1)
全血，通 常 用 E D T A 抗凝
P B S ，有 或 无 0.1% (m /V ) 叠氮钠，过滤除菌
单 克 隆 抗 体（标记的，未标记的或生物素化的），通过滴定确定最佳工作浓度
间 标 二 抗（仅用于未标记的一抗）
F T T C 标记的链霉亲和素或 P E 标记的链霉亲和素（仅用于生物素化的一抗）
裂解液：如低渗平衡盐溶液，去离子水， A C K 裂 解 液（附 录 1)，或商品化的裂解液（如 FACs-Iyse， Becton-Dickinson； Immuno-lyse, Coulter； Whole BloodLyse and Fix reagent, Gen Trak)
1 % (m /V ) 多聚甲醛， p H 7.4
12m m X 75m m 圆 底 离 心 管（Falcon)
Beckman 带 有 JS-4. 2 转子的 J-6M 冷 冻 离 心 机（或替代离心机）
1 . 采集患者的全血，对正在用单抗处理的或用单抗治疗后体内已经产生人抗鼠的抗体(H A M A ) 的患者，每 100ul 全血加入 3 ml P B S 洗涤。
2 . 当全血来源于白细胞增多患者时 O 15X 106 个白细胞/ml) ，应 用 P B S 稀释至约 8 XIO6 个细胞/m l 。
3 . 在 1 2m m X 7 5 m m 离心管中加入 IOOpil 全 血 及 适 量 的 单 抗（5 〜 2 0ul) 。 选用以下任一方法标记细胞：
a. 用一种或两种荧光标记的抗体进行直接法标记。
b. 用未标记的一抗和荧光标记的二抗进行间接法标记。
c. 用生物素化的一抗和 F T T C 或 P E 标记的链霉亲和素进行间接法标记。
对 照 的 设 置 包 括 ： 未 标 记 的 细 胞 、 同 型 抗 体 对 照 和 荧 光 标 记 的 无 关 抗 体 对 照(间 接 法 标 记 时）。
4 . 裂解液裂解红细胞（R B C ) (单 元 & 2 , 辅 助 方 案 1，商品化的裂解液参考说明书）。加 入 3〜4m l 含 有 0 . 1 % 叠 氮 钠 的 P B S 。 300 g 离 心 8 min。小心地吸弃上清，再洗涤两次。加 入 0.1 ml 1 % 多 聚 甲 醛（p H 7. 4)。
5 . 固定细胞。 4°C 避 光 待 检（< 1 周）。流式检测前加入 0.6〜1. O m l 无菌 的 P B S 。
6 . 设定前向角散射和侧向角散射参数以分别了解细胞的大小和物理特性（图 8.7.侧向角散射最好选用对数坐标（当然，也可使用线性坐标）。
7 . 通 过 设 门 技 术 可 以 用 荧 光 标 记 的 抗 体 识 别 单 核 细 胞（C D 1 4 + ) 和 所 有 白 细 胞
淋巴细胞门内的“污染的”单核/巨 噬 细 胞 （因为某些单核细胞的非荧光参数和淋巴细胞的极为相似）。用白细胞标志可 以 将非淋巴细胞（如细胞碎片、血小板、有核红细胞）设出门外，并且可以分析淋 巴细胞门内的细胞类型（图 8.7.2)，最大 限 度 地 圈 出 C D 45+/C D 14-淋巴细胞，建 立淋巴细胞门。考虑到假阳性的发生，门内单核细胞比例应大于5 % ( 图 8.7.3)。 应 用 C D 45/C D 1 4 进行荧光设门也可以证实淋巴细胞未被圈出淋巴门之外。若非荧光 参 数 （前向角和侧向角散射）淋巴细胞门包含了小于9 5 % 的淋巴细胞，则应重新设 门。值得注意的是大颗粒淋巴细胞，如白血病细胞或淋巴瘤细胞及活化的淋巴细胞 IO4 103 3 1〇 2 & IO1 104 IO3 S 102 IO1 IO 0 IO0 IO1 IO2 IO3 IO4 IO1 IO2 IO3 IO4 IO1 IO2 IO3 IO4 FLl FLl FLl 图 8. 7 . 2 代 表 抗 CD45 (FLl) 和 抗 CD14 (FL2 ) 荧光强度的双色等高线图。 A. 全血裂解物； B•经Ficoll分 离 后 ； C.Ficoll分离后去除了单核细胞。上一排代表了 分离后的所有白细胞，而下一排为淋巴细胞门内的细胞。三类主要的细胞亚群为单 核 细 胞 （M)、粒 细 胞 （G) 及 淋 巴 细 胞 （L)。" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469676435472yfz6h8whndpng_small.jpg" style="width: 465px; height: 671px;" />
实验步骤
基本方案
材 料（打 V 项 目 见 附 录 1)
全血，通 常 用 E D T A 抗凝
P B S ，有 或 无 0.1% (m /V ) 叠氮钠，过滤除菌
单 克 隆 抗 体（标记的，未标记的或生物素化的），通过滴定确定最佳工作浓度
间 标 二 抗（仅用于未标记的一抗）
F T T C 标记的链霉亲和素或 P E 标记的链霉亲和素（仅用于生物素化的一抗）
裂解液：如低渗平衡盐溶液，去离子水， A C K 裂 解 液（附 录 1)，或商品化的裂解液（如 FACs-Iyse， Becton-Dickinson； Immuno-lyse, Coulter； Whole BloodLyse and Fix reagent, Gen Trak)
1 % (m /V ) 多聚甲醛， p H 7.4
12m m X 75m m 圆 底 离 心 管（Falcon)
Beckman 带 有 JS-4. 2 转子的 J-6M 冷 冻 离 心 机（或替代离心机）
1 . 采集患者的全血，对正在用单抗处理的或用单抗治疗后体内已经产生人抗鼠的抗体(H A M A ) 的患者，每 100ul 全血加入 3 ml P B S 洗涤。
2 . 当全血来源于白细胞增多患者时 O 15X 106 个白细胞/ml) ，应 用 P B S 稀释至约 8 XIO6 个细胞/m l 。
3 . 在 1 2m m X 7 5 m m 离心管中加入 IOOpil 全 血 及 适 量 的 单 抗（5 〜 2 0ul) 。 选用以下任一方法标记细胞：
a. 用一种或两种荧光标记的抗体进行直接法标记。
b. 用未标记的一抗和荧光标记的二抗进行间接法标记。
c. 用生物素化的一抗和 F T T C 或 P E 标记的链霉亲和素进行间接法标记。
对 照 的 设 置 包 括 ： 未 标 记 的 细 胞 、 同 型 抗 体 对 照 和 荧 光 标 记 的 无 关 抗 体 对 照(间 接 法 标 记 时）。
4 . 裂解液裂解红细胞（R B C ) (单 元 & 2 , 辅 助 方 案 1，商品化的裂解液参考说明书）。加 入 3〜4m l 含 有 0 . 1 % 叠 氮 钠 的 P B S 。 300 g 离 心 8 min。小心地吸弃上清，再洗涤两次。加 入 0.1 ml 1 % 多 聚 甲 醛（p H 7. 4)。
5 . 固定细胞。 4°C 避 光 待 检（< 1 周）。流式检测前加入 0.6〜1. O m l 无菌 的 P B S 。
6 . 设定前向角散射和侧向角散射参数以分别了解细胞的大小和物理特性（图 8.7.侧向角散射最好选用对数坐标（当然，也可使用线性坐标）。
7 . 通 过 设 门 技 术 可 以 用 荧 光 标 记 的 抗 体 识 别 单 核 细 胞（C D 1 4 + ) 和 所 有 白 细 胞
