Fcγ 受 体 介 导 的 黏 附 作 用 和 吞 噬 作 用 的 检 测
实验原理
基本方案 FcY 受体介导的吞噬作用
材 料
原代巨噬细胞或巨噬细胞株（单 元 6.1 和 8. 5)
R P M I -5 完 全 培 养 基（或其他培养基）
绵 羊 红 细 胞（S R B C ) ，用 Alsever 溶 液 I : I (V /V ) 稀 释（附 录 1)
生理盐水： 0. 9 % (m /V ) NaCl
200〜900 Ci/g N a 251CrO4 (30 000 Ci/m m o l ， ICN Biomedicals 或 DuPont N E N ) ，生理盐水配制
多克隆抗 S R B C 抗 体（如 Diamedix) 或 抗 FcyRI 单 克 隆 IgG2a 型 抗 体（即调理素，杂交瘤 S.S-I ， A T C C )
A C K 裂解液
0.5% (m /V ) SDS 溶液
刺 激 剂（如 小 鼠 IFN-cx /卩；其他活化剂见单元 6.4)
8 道 移 液 器（如 Costar Octapette)
9 6 孔平底细胞培养板（Falcon 或 Costar)
7 液闪仪和 7 液闪管
15m l 和 50m l 锥底离心管
I E C 离 心 机（临床型）
上 清 收 集 系 统（S C S ; Skatron)
1 . 制备巨噬细胞悬液，调整浓度至 2. 5 X IO6个细胞/m l 。用 8 道 移 液 器 在 9 6 孔平底培养板每孔中加入 l 〇〇 Ml 细胞悬液。各实验组及对照组均设 3 复孔。置细胞培养箱中培养 直 至 细 胞 贴 壁（小鼠腹腔巨噬细胞需 4 h 以上，其他分化较差的巨噬细胞可能需更
长时间）。
2.加入相应的刺激剂，以刺激巨噬细胞 F c y R 的表达。 I 型干扰素，如 IFN-a 或 IFN-p，lOOU/m l ，作 用 48 h 后能显著上调巨噬细胞 F c y R 的表达，可作阳性对照。单独培养基处理组作为阴性对照。不同刺激剂调节 F c y R 表达的最适浓度需根据预实验确定。
3 . 将 7 液闪管标记编号
黏附于巨噬细胞表面的S R - B C 。需控制裂解液作用时间，使 S R B C 恰好完全裂解，时间过长则会导致巨噬细 胞的裂解。 13•吸弃细胞裂解液。加 入 IOOju I 细胞培养基。 14•加入100M1 5 % S D S ，室温作用5〜IOmin以裂解巨噬细胞。 15.用 S C S 吸收巨噬细胞裂解液2〜5min。将 S C S 滤纸片放入相应的7 液闪管，用 7 液 闪仪检测。" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469606286503a2up59mhw4png_small.jpg" style="width: 452px; height: 667px;" />
辅 助 方 案 Fcyr 介导的黏附作用
材 料
附 加 材 料（其他材料见基本方案)
150m mol/L 碘 乙 酸（iodoacetic acid， I A A ; 新鲜配制，避光保存)
2 4 孔平底细胞培养板（Costar 或 Falcon)
振荡器，培养板型
1 . 制备巨嗟细胞悬液，调整浓 度 至 8 X 105 个细胞/ml 。在 2 4 孔 板 中 加 入 500ul 细胞悬液 。各实验组和对照组至少设 2 复孔。 2 4 孔板置细胞培养箱中培养待细胞贴壁后，加 入 刺 激 剂（见基本方案，步 骤 1 和 2)。
2 . 制备同位素标记且抗体调理的 S R B C (见基本方案，步 骤 4〜7)。在 9.9 ml S R B C 悬液中加入 0. I m l l 50m mol/L 碘乙酸，抑制巨噬细胞吞噬功能。
3 . 将 IOOUl SR B C 上清加至含 S C S 的 7 液闪管中，读 取 cp m 值（此值为巨噬细胞最大黏 附 cp m 值 的 1/5)。
4 . 吸弃巨噬细胞培养上清。加 入 500^1 碘乙酸处理后的 S R B C 悬 液 ，孵 育 I h 或合适的时 间（见基本方案，步 骤 10)。
5 . 轻轻吸弃未黏附的 S R B C 悬液。用 I m l 移液器沿孔壁缓慢加入 500ul 培养基洗涤细胞 ，避免吹起巨噬细胞。重复洗涤 3 次 ，充分洗去未黏附的 S R B C 。
注意：应在一块 培 养 板 洗 涤 全 部 结 束 后 再 开 始 第 二 块 培 养 板 的 洗 涤 。
6 . 加 人 500W 浓度 为 0 . 5 % 的 SD S， 轻摇培养板约 10 min，裂解巨噬细胞。
7 . 将 7 液闪管编号标记，加 入 S C S 滤纸。用 I m l 移 液 器 吸 取 400M1 巨噬细胞裂解液，小心加到相应的 7 液闪管中，用 7 液闪仪检测 cp m 值 。
8.计算各样品的平均值（见基本方案，步 骤 16〜17)。结果以 S R B C 结合量表示时，应将 400ul 裂解液的 cp m 值 换 算 成 500ul 裂解液总量的 cp m 值
实验步骤
基本方案 FcY 受体介导的吞噬作用
材 料
原代巨噬细胞或巨噬细胞株（单 元 6.1 和 8. 5)
R P M I -5 完 全 培 养 基（或其他培养基）
绵 羊 红 细 胞（S R B C ) ，用 Alsever 溶 液 I : I (V /V ) 稀 释（附 录 1)
生理盐水： 0. 9 % (m /V ) NaCl
200〜900 Ci/g N a 251CrO4 (30 000 Ci/m m o l ， ICN Biomedicals 或 DuPont N E N ) ，生理盐水配制
多克隆抗 S R B C 抗 体（如 Diamedix) 或 抗 FcyRI 单 克 隆 IgG2a 型 抗 体（即调理素，杂交瘤 S.S-I ， A T C C )
A C K 裂解液
0.5% (m /V ) SDS 溶液
刺 激 剂（如 小 鼠 IFN-cx /卩；其他活化剂见单元 6.4)
8 道 移 液 器（如 Costar Octapette)
9 6 孔平底细胞培养板（Falcon 或 Costar)
7 液闪仪和 7 液闪管
15m l 和 50m l 锥底离心管
I E C 离 心 机（临床型）
上 清 收 集 系 统（S C S ; Skatron)
1 . 制备巨噬细胞悬液，调整浓度至 2. 5 X IO6个细胞/m l 。用 8 道 移 液 器 在 9 6 孔平底培养板每孔中加入 l 〇〇 Ml 细胞悬液。各实验组及对照组均设 3 复孔。置细胞培养箱中培养 直 至 细 胞 贴 壁（小鼠腹腔巨噬细胞需 4 h 以上，其他分化较差的巨噬细胞可能需更
长时间）。
2.加入相应的刺激剂，以刺激巨噬细胞 F c y R 的表达。 I 型干扰素，如 IFN-a 或 IFN-p，lOOU/m l ，作 用 48 h 后能显著上调巨噬细胞 F c y R 的表达，可作阳性对照。单独培养基处理组作为阴性对照。不同刺激剂调节 F c y R 表达的最适浓度需根据预实验确定。
3 . 将 7 液闪管标记编号
辅 助 方 案 Fcyr 介导的黏附作用
材 料
附 加 材 料（其他材料见基本方案)
150m mol/L 碘 乙 酸（iodoacetic acid， I A A ; 新鲜配制，避光保存)
2 4 孔平底细胞培养板（Costar 或 Falcon)
振荡器，培养板型
1 . 制备巨嗟细胞悬液，调整浓 度 至 8 X 105 个细胞/ml 。在 2 4 孔 板 中 加 入 500ul 细胞悬液 。各实验组和对照组至少设 2 复孔。 2 4 孔板置细胞培养箱中培养待细胞贴壁后，加 入 刺 激 剂（见基本方案，步 骤 1 和 2)。
2 . 制备同位素标记且抗体调理的 S R B C (见基本方案，步 骤 4〜7)。在 9.9 ml S R B C 悬液中加入 0. I m l l 50m mol/L 碘乙酸，抑制巨噬细胞吞噬功能。
3 . 将 IOOUl SR B C 上清加至含 S C S 的 7 液闪管中，读 取 cp m 值（此值为巨噬细胞最大黏 附 cp m 值 的 1/5)。
4 . 吸弃巨噬细胞培养上清。加 入 500^1 碘乙酸处理后的 S R B C 悬 液 ，孵 育 I h 或合适的时 间（见基本方案，步 骤 10)。
5 . 轻轻吸弃未黏附的 S R B C 悬液。用 I m l 移液器沿孔壁缓慢加入 500ul 培养基洗涤细胞 ，避免吹起巨噬细胞。重复洗涤 3 次 ，充分洗去未黏附的 S R B C 。
注意：应在一块 培 养 板 洗 涤 全 部 结 束 后 再 开 始 第 二 块 培 养 板 的 洗 涤 。
6 . 加 人 500W 浓度 为 0 . 5 % 的 SD S， 轻摇培养板约 10 min，裂解巨噬细胞。
7 . 将 7 液闪管编号标记，加 入 S C S 滤纸。用 I m l 移 液 器 吸 取 400M1 巨噬细胞裂解液，小心加到相应的 7 液闪管中，用 7 液闪仪检测 cp m 值 。
8.计算各样品的平均值（见基本方案，步 骤 16〜17)。结果以 S R B C 结合量表示时，应将 400ul 裂解液的 cp m 值 换 算 成 500ul 裂解液总量的 cp m 值
