基本方案

材料

待 测 单 个 核 细 胞（肝素抗凝血或肝素抗凝骨髓）或 外 周 血 单 个 核 细 胞（单 元 8.1)或者单核/巨 噬 细 胞（单 元 8. 5 , 推荐采用阴性分选）

PBS

PBS/肝素：含 0.1% (V/V ) 肝 素 的 PBS

阻 断 IgG，浓 度 3 mg/ml (如正常小鼠 IgG， Caltag)

荧光素标记的单克隆抗体（表 6. 3. 2)

E M A (Ethidium monoazide) 溶液

A C K 裂 解 液（新鲜配制，室温保存应< 1 2 h)

7 2 % (m /V ) 甲醛

12m m X 75m m 试管

15m l 锥 底 塑 料 离 心 管（Falcon)

低 功 率 白 炽 灯（如 40W 白炽灯）

Sorvall R T 6000B 离心机和转子

la. 使用肝素抗凝血或抗凝骨髓时：在 15m l 锥底塑料离心管中加入约 IOml 抗凝血或1〜3ml抗凝骨髓， 4℃， 1500g离心 3min。弃血 浆 ，加入 1 〇ml PBS/肝素，盖紧
巨噬细胞时：用 P B S 调整细胞浓度至2 X 107个细胞/m l 。 2 . 准 备 7 只 12m m X 75m m 试管，将 试 管 1〜7 编号，每 管 加 入 50|ul细 胞 悬 液 （I X l O 6 个细胞）。 3 . 加 入 年 1浓 度 为 3m g /m l 的正常小鼠IgG， 4°C (置冰上）孵 育 lOmin。 4 . 按 表 6. 3. 3 所示，在 1〜5 号试管中加入适量的一抗。将 1〜6 号试管冰浴15min。 5 号管含同型对照Ig，为非特异结合对照管。 6 号管为细胞自发焚光对照，用于 调 定 光 电 倍 增 管 电 压 （photomultiplier， P M T ) ，这一点对巨嗤细胞的检测尤为 重要。 5 . 在 7 号管中加入5M1 E M A 溶液，混匀。将 试 管 放 在 白 炽 灯 （如 40W 白炽灯） 18cm 远处，室温静置l〇min。 6 . 若 样 品 含 红 细 胞 （如 新 鲜 骨 髓 或 脾 脏 ），加 入 3ml A C K 裂 解 液 。否 则 ，加人 3ml P B S 0 7 . 盖紧试管盖，颠倒试管1〜2 次 ，将细胞混勻后，室温静置3min。 8. 4°C ， 150吆 离 心 3min。倒掉上清，试管直立后，用手指轻轻弹松管底细胞沉淀。 9 . 加 入 3ml P B S 洗涤细胞，方法同步骤7 和 8。 IOa. 直接检测时：加 入 200julPBS重悬细胞， 4°C 避 光 待 检 （可保存< 4 h)。 10b. 固定后检测时：加 入 100jul2 % 甲醛，混匀，加盖， 4°C 避光固定I h 后待检。 甲醛会改变细胞的光散射值。 1 1 . 用流式细胞仪进行检测，然 后 用 FACScan分析结果" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469600670967vafagyeytrpng_small.jpg" style="width: 567px; height: 446px;" />