PCR 扩增 SSLP 用于自动荧光分型实验
实验原理
支持方案1 混合用于基因分型的荧光标记的 PCR 产物
微卫星标记的引物都是特异性的染料标记的， '引 物 可 以 被 1〜3 种染料： Fam (6-友基焚光素） 、 Hex (4， 7， 2 ， 4 ， 5'， 7’-穴氣焚光素-6-嚴基荧光素）或 者 Tet (4， 7， 2'， 7'-四氯荧光素-6-羧基焚光素）标记。这些染料的亮度不同， H e x 大约是F a m 或 T e t 亮度的一半。需要一些预实验来决定混合的量，可以 根 据 所用的 仪器变化。混合太多的产物将导致胶超载，混合太少的量将导致太少的信号。在 A B I 的仪器上P C R 产物的荧光范围可以为200〜2000个荧光单位" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469515317152wd7nr2jbg2png_small.jpg" style="width: 435px; height: 624px;" />
支持方案2 混合好的 PCR 产物电泳
1.打开测序仪和电脑。
2.把6%24 cmweU-to-read丙婦酰胺胶的夹子去掉，将多余的胶用水冲洗干净，把玻璃板上灰尘弹掉。缓慢地移去梳子，用水冲洗掉多余的丙烯酰胺胶。晾干玻璃板或者在干净的Kimwipe中烤干玻璃板。
对于一个 96 孔需上样的板子，下面描述的过程使用的是3个32 孔的肢，2个48孔的胶同样可以使用。
3.打开自动测序仪前面舱的门，把低的缓冲液槽子装在舱的下面，将一个干净的胶放在舱里，使其平面正好对着激光室，胶板的底部放在低的槽子的对面。确保胶的方向是正确的，有耳的一面向里。
4.看一下胶扫描的区域是否有黏着在板子上的胶碎片，如果需要，用一块潮湿的Kim_wipe将其擦干净。用黑色的间隔片将胶锁在正确的位置，关上舱门。
5.调整光电倍增管（PMT) 的电压，用373A 键区，选择MainMenu, 选Calibration, 然后选Configure核查运行的参数。检查默认的参数，如果需要可进行修改。
运行时间：5 h30 min1070V
出现数据通信的错误时运行不会终止
滤过器轮B
激光功率是40mA/30 mW
6.鼠标和键盘在Genescan672收集软件的菜单窗口中选择Scan和Map，在 373A主菜单上用主键区选择StartPre-run然后PlateCheck。选择FullScan 开始扫描胶板。
如果读般的区域是干净的，扫描将会看起来像平线，在胶的宽面的图将会全是灰色。如果扫描有明显的峰和图上有有颜色的蜂，那是在玻璃板的激光读数的区域有碎胶或灰尘。这时必须打开电泳舱，将玻璃板的两面都擦干净。用潮湿的Kim一wipe擦时最好从水平方向擦拭。重新按照以上描述检查胶是否干净，如果需要重复擦拭直到胶读数的区域是干净的。
扫描如显示一个峰包括4种颜色，这是由于胶的不规则造成的，这是不能够被擦干净的。然而，随着缓冲液在胶里跑这个问题会自动消失^如果遇到这样奇怪的峰，注意扫描窗口峰的X轴，这个值和信道数是等同的，可以用于决定哪一道人造峰将被显示二根^信道值决定36孔梳子的道数，如果胶不规则则在上样时跳过这道。
7.用鼠标指示扫描的最低的颜色行，扫描的左下角是1轴和^轴的坐标。检查最下面一行3^轴的PMT值。
y值应该在800的2〇个单位内，3；值是根据373A键区里设置菜单的PMT的值调f的。设置菜单可通过主菜单里的 Caiibration达到。升高pMT值亦升高^值。
8.重复第2~7步直到每个胶板都在电泳舱上装置好，都是干净的扫描区域和正确的PMT值。
9.通过旋转螺旋夹直到垫圈变平和用手旋紧夹子将上面的缓冲液槽安到安全的玻璃板上。加IXTBE电泳缓冲液到上面的缓冲液槽，小心操作勿将缓冲液滴到读数的区域否则要再擦干净并重新扫描。用IXTBE缓冲液灌上面的缓冲液槽直到高于最高的孔大约0.5 cm和距最上面的舱大约lcm，灌下面的缓冲液槽直到距离槽的顶大约1 cm。确保下面舱的电线是覆盖着的，检查上面缓冲液槽的垫圈是否密封好。
每台仪器大约需要I.5L的1 X TBE。
10.用一个60 ml的注射器，用1 x TBE 冲洗胶孔。把针头的顶部正好放在上面的缓冲液槽的两块玻璃板之间。
11.芒果需要，将一个塑料的指示带放到玻璃板的外面，这样相应的胶孔的顺序可以显示。检查胶是否有断掉的孔沿、气泡或者坏的胶孔。注意如果有任何胶孔有这些问题都不能上样。
12.将要上样的板子放在冰盒里，将开始 4 列（A1~A4)的塑料封条扯掉。将微量移液器调到知 1，在孔 Al 里吸取样本，将 tip 的平面放到两块玻璃板之间，大概—半伸入第一个胶孔里，缓慢的将样本打入胶孔，拔出 tip。小心胶孔别太满，防止样本流入下一个胶孔里。如果相邻的胶孔污染了，则跳过它，做个标记。
13.继续从上样板里吸取样本上样，直到 Hl 孔，然后移到下一列从 A2孔到 H2 孑 L。
将板子的前 4 列上到前三块胶，如果胶上样错了，要在胶孔上注明上错的那—道。
14.当胶全部上样完了，把塑料指示带从玻璃板上取下，插上上面和下面缓冲液槽子的电源，关上电泳舱的门。在373A 的测序键区，按下 ChooseRim 按钮，选择 GenescanRun开始电泳，立即用鼠标指示绿色的Coliect 按钮开始 Genescan 收集。.
Collect 按钮将开始闪烁以核实收集开始，如果绿色的按钮没有开始闪烁，按下 373A键区的 StopRun 按钮，从有经验的人那里得到帮助。
15.重复第 9~14 步将 A4~H8 和 A9~H12 上样到另外两块胶上，当所有的三个仪器全部上样完成、Genescan 收集开始时，最后检查收集的按钮是否闪烁。当跑胶完成时，检查错误。
Genescan 在收集过程中不应该有任何的错误，373 键区应该显示执行时间用了 5.5 h。
16.关掉 373A 测序仪，打开电泳舱的门，拿住胶板，上缓冲液槽仍在上面，仍是对着激光室，打开两边的插销将黑色的带子从胶丄撕掉。将胶和上缓冲液槽一起拿出电泳舱，拿到水槽处倒掉缓冲液，将上缓冲液槽从胶上取下。
17.小心地将下缓冲液槽从电泳舱里取出倒掉缓冲液，冲洗两个槽子后放到测序仪下面。用潮湿的纸巾将电泳舱内洒的液体擦干净，关上电泳舱的门，其他的胶板重复此步骤。
18.分析股，根据生产厂家的说明书用 Genescan Analysis 和 Genotyper 软件分析等位基因型。
实验材料
实验步骤
支持方案1 混合用于基因分型的荧光标记的 PCR 产物
支持方案2 混合好的 PCR 产物电泳
1.打开测序仪和电脑。
2.把6%24 cmweU-to-read丙婦酰胺胶的夹子去掉，将多余的胶用水冲洗干净，把玻璃板上灰尘弹掉。缓慢地移去梳子，用水冲洗掉多余的丙烯酰胺胶。晾干玻璃板或者在干净的Kimwipe中烤干玻璃板。
对于一个 96 孔需上样的板子，下面描述的过程使用的是3个32 孔的肢，2个48孔的胶同样可以使用。
3.打开自动测序仪前面舱的门，把低的缓冲液槽子装在舱的下面，将一个干净的胶放在舱里，使其平面正好对着激光室，胶板的底部放在低的槽子的对面。确保胶的方向是正确的，有耳的一面向里。
4.看一下胶扫描的区域是否有黏着在板子上的胶碎片，如果需要，用一块潮湿的Kim_wipe将其擦干净。用黑色的间隔片将胶锁在正确的位置，关上舱门。
5.调整光电倍增管（PMT) 的电压，用373A 键区，选择MainMenu, 选Calibration, 然后选Configure核查运行的参数。检查默认的参数，如果需要可进行修改。
运行时间：5 h30 min1070V
出现数据通信的错误时运行不会终止
滤过器轮B
激光功率是40mA/30 mW
6.鼠标和键盘在Genescan672收集软件的菜单窗口中选择Scan和Map，在 373A主菜单上用主键区选择StartPre-run然后PlateCheck。选择FullScan 开始扫描胶板。
如果读般的区域是干净的，扫描将会看起来像平线，在胶的宽面的图将会全是灰色。如果扫描有明显的峰和图上有有颜色的蜂，那是在玻璃板的激光读数的区域有碎胶或灰尘。这时必须打开电泳舱，将玻璃板的两面都擦干净。用潮湿的Kim一wipe擦时最好从水平方向擦拭。重新按照以上描述检查胶是否干净，如果需要重复擦拭直到胶读数的区域是干净的。
扫描如显示一个峰包括4种颜色，这是由于胶的不规则造成的，这是不能够被擦干净的。然而，随着缓冲液在胶里跑这个问题会自动消失^如果遇到这样奇怪的峰，注意扫描窗口峰的X轴，这个值和信道数是等同的，可以用于决定哪一道人造峰将被显示二根^信道值决定36孔梳子的道数，如果胶不规则则在上样时跳过这道。
7.用鼠标指示扫描的最低的颜色行，扫描的左下角是1轴和^轴的坐标。检查最下面一行3^轴的PMT值。
y值应该在800的2〇个单位内，3；值是根据373A键区里设置菜单的PMT的值调f的。设置菜单可通过主菜单里的 Caiibration达到。升高pMT值亦升高^值。
8.重复第2~7步直到每个胶板都在电泳舱上装置好，都是干净的扫描区域和正确的PMT值。
9.通过旋转螺旋夹直到垫圈变平和用手旋紧夹子将上面的缓冲液槽安到安全的玻璃板上。加IXTBE电泳缓冲液到上面的缓冲液槽，小心操作勿将缓冲液滴到读数的区域否则要再擦干净并重新扫描。用IXTBE缓冲液灌上面的缓冲液槽直到高于最高的孔大约0.5 cm和距最上面的舱大约lcm，灌下面的缓冲液槽直到距离槽的顶大约1 cm。确保下面舱的电线是覆盖着的，检查上面缓冲液槽的垫圈是否密封好。
每台仪器大约需要I.5L的1 X TBE。
10.用一个60 ml的注射器，用1 x TBE 冲洗胶孔。把针头的顶部正好放在上面的缓冲液槽的两块玻璃板之间。
11.芒果需要，将一个塑料的指示带放到玻璃板的外面，这样相应的胶孔的顺序可以显示。检查胶是否有断掉的孔沿、气泡或者坏的胶孔。注意如果有任何胶孔有这些问题都不能上样。
12.将要上样的板子放在冰盒里，将开始 4 列（A1~A4)的塑料封条扯掉。将微量移液器调到知 1，在孔 Al 里吸取样本，将 tip 的平面放到两块玻璃板之间，大概—半伸入第一个胶孔里，缓慢的将样本打入胶孔，拔出 tip。小心胶孔别太满，防止样本流入下一个胶孔里。如果相邻的胶孔污染了，则跳过它，做个标记。
13.继续从上样板里吸取样本上样，直到 Hl 孔，然后移到下一列从 A2孔到 H2 孑 L。
将板子的前 4 列上到前三块胶，如果胶上样错了，要在胶孔上注明上错的那—道。
14.当胶全部上样完了，把塑料指示带从玻璃板上取下，插上上面和下面缓冲液槽子的电源，关上电泳舱的门。在373A 的测序键区，按下 ChooseRim 按钮，选择 GenescanRun开始电泳，立即用鼠标指示绿色的Coliect 按钮开始 Genescan 收集。.
Collect 按钮将开始闪烁以核实收集开始，如果绿色的按钮没有开始闪烁，按下 373A键区的 StopRun 按钮，从有经验的人那里得到帮助。
15.重复第 9~14 步将 A4~H8 和 A9~H12 上样到另外两块胶上，当所有的三个仪器全部上样完成、Genescan 收集开始时，最后检查收集的按钮是否闪烁。当跑胶完成时，检查错误。
Genescan 在收集过程中不应该有任何的错误，373 键区应该显示执行时间用了 5.5 h。
16.关掉 373A 测序仪，打开电泳舱的门，拿住胶板，上缓冲液槽仍在上面，仍是对着激光室，打开两边的插销将黑色的带子从胶丄撕掉。将胶和上缓冲液槽一起拿出电泳舱，拿到水槽处倒掉缓冲液，将上缓冲液槽从胶上取下。
17.小心地将下缓冲液槽从电泳舱里取出倒掉缓冲液，冲洗两个槽子后放到测序仪下面。用潮湿的纸巾将电泳舱内洒的液体擦干净，关上电泳舱的门，其他的胶板重复此步骤。
18.分析股，根据生产厂家的说明书用 Genescan Analysis 和 Genotyper 软件分析等位基因型。
