T 细 胞 克 隆 的 建 立
实验原理
基本方案 1 产生和维持同种反应性 T h 和 CTL 克隆
尽管同种反应性 T 细胞可以从未刺激的脾细胞或淋巴结细胞中产生，但如果细胞在初次混合淋巴细胞（M L C ) 中第一次被同种抗原刺激，反应细胞的得率会更高。见以下介绍。
材 料
同种反应性小鼠脾脏 T 细胞
V H B S S (可选使用）
V D M E M -20 完全培养基
经 照 射 的（2000rad，单 元 2. 1 1 ) 同种异基因型小鼠脾脏 T 细胞
生长因子： M L C 或 Con A 刺激的细 胞 上 清（见辅助方案 1 或 2)，重组细胞因子
9 6 孔 平 底 培 养 板（Costar)
2 4 孔 细 胞 培 养 板（Linbro， Costar
1 . 在体外用同种异型抗原致敏同种反应性 T 细 胞 10〜M d (见 辅 助 方 案 2 , 步 骤 1)，最好使用 H B S S 或 D M E M 溶 液（即与小鼠血清等渗的溶液）。
2 . 准备再次刺激用的 M L C (见辅助方案 2 , 步 骤 3)，培 养 36〜48 h 。
3.将经照射（2000rad) 的同种异 型 脾 T 细 胞 ，用 D M E M -2 0 培养基调节细胞浓度为IO7 个细胞/m l ，每 孔 100ul 加 入 到 9 6 孔平底板中。
4 . 从再次刺激用的 M L C 体 系 中 收 集 T 细 胞（步 骤 2)，重 悬 于 D M E M -20 中并计数(附录 3A )。
5.将重悬的 T 细 胞 用 M L C 或 Con A (作为细胞因子）激 活 的 上 清 稀 释 到 1〜1 0 个细胞/m l ， 50ul 每孔加入步骤 3 的 9 6 孔板中， 37°C 培 养 4d。
6 . 在每孔中加入 50ul M L C 激活的上清和 5 〇 M D M E M -I O 培养基。培 养 7 〜IOd 直到在倒置显微镜下可在一些孔中观察到有明显的细胞集落形成。
7a. 用 51C r 微量释放实验检测细胞毒活性：用 51C r 微 量 释 放 实 验 检 测 细 胞 毒 活 性（Engers and Fitch; 单 元 2. 10)，区分同种反应性 C T L 和 T h 细胞。如果细胞毒活性试验显示阴性，进一步用单元 2. 1 1 所示的增殖试验检测 T h 细胞的存在。
7b. 检 测 IL-2 或 IL-4 的产生：用 抗 原（单 元 5. 1 ) 再 次 刺 激 检 测 IL-2 或 IL- 4 的产生，或用表面表达 C D 4 或 C D 8 (单 元 4. 1 和单元 4. 2 ) 筛选。
8 . 鉴定同种反应性 T 细胞克隆是否具有应有的特征（特异的细胞毒活性和特异性细胞因子的产生）。
9 . 按如下方法维持克隆的细胞：从原来的 9 6 孔板转移 IOOiUl 细 胞 悬 液（含 2. 5 X IO4〜I X lO5 个细胞）到 0. 9m l 含 6 X lO 6 个经照射的同种异型脾细胞和 0. 5 ml M L C 激活的上清的 2 4 孔细胞培养板，补 加 D M E M -20 培养基使终体积达每孔 I.5m l 。每隔一周按此种方法传代细胞。
基本方案 2 用可溶性蛋白抗原诱导 T h 克隆
不 要 臆 断 T C R 转基因小鼠是单克隆性的，因为它们会含有内源性 T C R 基因重排的细胞。
材 料
m a n ， 1982)。
9.一旦获得足够数量的细胞，通 过 检 测 IL-2、 IL-4 和 IFN-Y 的 产 生（单 元 5 . 1 ) 鉴定新产生的克隆。
生 长 因 子 来 源 的 条 件 培 养 基 的 制 备
在选择一种条件培养基之前必须考虑的一个重要因素是，每种培养基包含不同的细胞因子谱。
辅助方案 1 制备刀豆蛋白 A 活化的上清（C c m A 上清）
辅助方案 2 制备混合淋巴细胞培养上清（M L C 上清）
辅助方案 3 制备 P M A 激活的 E L -4 淋巴瘤细胞上清（E L -4 上清）
辅助方案 4 用显微操作的方法克隆
与有限稀释法比较，更推荐使用重复显微操作的方法培养克隆，它是确保克隆形成能力的唯一方法。
附 加 材 料（其 他 材料 见基 本 方案 2)
微 毛 细 管（如微量血细胞比容管， BectonDickinson)
实验步骤
基本方案 1 产生和维持同种反应性 T h 和 CTL 克隆
尽管同种反应性 T 细胞可以从未刺激的脾细胞或淋巴结细胞中产生，但如果细胞在初次混合淋巴细胞（M L C ) 中第一次被同种抗原刺激，反应细胞的得率会更高。见以下介绍。
材 料
同种反应性小鼠脾脏 T 细胞
V H B S S (可选使用）
V D M E M -20 完全培养基
经 照 射 的（2000rad，单 元 2. 1 1 ) 同种异基因型小鼠脾脏 T 细胞
生长因子： M L C 或 Con A 刺激的细 胞 上 清（见辅助方案 1 或 2)，重组细胞因子
9 6 孔 平 底 培 养 板（Costar)
2 4 孔 细 胞 培 养 板（Linbro， Costar
1 . 在体外用同种异型抗原致敏同种反应性 T 细 胞 10〜M d (见 辅 助 方 案 2 , 步 骤 1)，最好使用 H B S S 或 D M E M 溶 液（即与小鼠血清等渗的溶液）。
2 . 准备再次刺激用的 M L C (见辅助方案 2 , 步 骤 3)，培 养 36〜48 h 。
3.将经照射（2000rad) 的同种异 型 脾 T 细 胞 ，用 D M E M -2 0 培养基调节细胞浓度为IO7 个细胞/m l ，每 孔 100ul 加 入 到 9 6 孔平底板中。
4 . 从再次刺激用的 M L C 体 系 中 收 集 T 细 胞（步 骤 2)，重 悬 于 D M E M -20 中并计数(附录 3A )。
5.将重悬的 T 细 胞 用 M L C 或 Con A (作为细胞因子）激 活 的 上 清 稀 释 到 1〜1 0 个细胞/m l ， 50ul 每孔加入步骤 3 的 9 6 孔板中， 37°C 培 养 4d。
6 . 在每孔中加入 50ul M L C 激活的上清和 5 〇 M D M E M -I O 培养基。培 养 7 〜IOd 直到在倒置显微镜下可在一些孔中观察到有明显的细胞集落形成。
7a. 用 51C r 微量释放实验检测细胞毒活性：用 51C r 微 量 释 放 实 验 检 测 细 胞 毒 活 性（Engers and Fitch; 单 元 2. 10)，区分同种反应性 C T L 和 T h 细胞。如果细胞毒活性试验显示阴性，进一步用单元 2. 1 1 所示的增殖试验检测 T h 细胞的存在。
7b. 检 测 IL-2 或 IL-4 的产生：用 抗 原（单 元 5. 1 ) 再 次 刺 激 检 测 IL-2 或 IL- 4 的产生，或用表面表达 C D 4 或 C D 8 (单 元 4. 1 和单元 4. 2 ) 筛选。
8 . 鉴定同种反应性 T 细胞克隆是否具有应有的特征（特异的细胞毒活性和特异性细胞因子的产生）。
9 . 按如下方法维持克隆的细胞：从原来的 9 6 孔板转移 IOOiUl 细 胞 悬 液（含 2. 5 X IO4〜I X lO5 个细胞）到 0. 9m l 含 6 X lO 6 个经照射的同种异型脾细胞和 0. 5 ml M L C 激活的上清的 2 4 孔细胞培养板，补 加 D M E M -20 培养基使终体积达每孔 I.5m l 。每隔一周按此种方法传代细胞。
基本方案 2 用可溶性蛋白抗原诱导 T h 克隆
不 要 臆 断 T C R 转基因小鼠是单克隆性的，因为它们会含有内源性 T C R 基因重排的细胞。
材 料
m a n ， 1982)。
9.一旦获得足够数量的细胞，通 过 检 测 IL-2、 IL-4 和 IFN-Y 的 产 生（单 元 5 . 1 ) 鉴定新产生的克隆。
生 长 因 子 来 源 的 条 件 培 养 基 的 制 备
在选择一种条件培养基之前必须考虑的一个重要因素是，每种培养基包含不同的细胞因子谱。
辅助方案 1 制备刀豆蛋白 A 活化的上清（C c m A 上清）
辅助方案 2 制备混合淋巴细胞培养上清（M L C 上清）
辅助方案 3 制备 P M A 激活的 E L -4 淋巴瘤细胞上清（E L -4 上清）
辅助方案 4 用显微操作的方法克隆
与有限稀释法比较，更推荐使用重复显微操作的方法培养克隆，它是确保克隆形成能力的唯一方法。
附 加 材 料（其 他 材料 见基 本 方案 2)
微 毛 细 管（如微量血细胞比容管， BectonDickinson)
