T 淋巴细胞增殖实验
实验原理
基 本 方 案 1 未 致 敏 T 淋巴细胞的活化
材 料
备选方案1 用抗体激活未致敏的T 细胞
这种方法适用于当抗C D 3/T C R 复合物抗体不能有效结合小鼠辅助细胞上的F c 受体 ，或其可溶形式不能有效活化T 细胞时。值得注 意 的 是 ，在 某 种 抗 体（如 抗 G 7、Thy-I 单克隆抗体）很难诱导T 细胞增殖反应的情况下，推荐采用基本方案1。
附 加 材 料
P B S (室温和 4°C )
用 P B S 配 制 lm g /m l 纯化的抗C D 3 或 抗 T C R 单 克 隆 抗 体（非特异性活化T 细胞)或 lmg/m l 纯 化 的 抗 V 卩或抗T C R -y S 单 克 隆 抗 体（特 异 性 激 活 T 细胞 ，表
2.11.1)
1.在 4 ml聚苯乙烯圆锥底离心管中，用 无 菌 室 温 PBS (不含蛋白质）将 lmg/ml无菌的 单 克 隆 抗 体 储 存 液（表 2.11.1)，根 据 实 验 需 要 配 制 4 个 浓 度 的 工 作 液 ：如lOOug/ml、 10ug/ml、 1ug/ml、 O.lug/ml， 临用前配制。
2 .加 30ul各浓度的抗体工作液（每孔最多结合2〜3 ug ; 最佳浓度通常为10ug/ml) 至9 6 孔 圆 底 板 中（每种单抗使用一行），用 30/xl P B S 作为对照孔。
3 . 盖好板盖，轻拍培养板侧面确保液体完全覆盖孔底。 37°C 培 养 90 min，或 者 4°C 培养过夜。培养的同时进行下一步操作。
4 . 同基本方案1 中的步骤1〜3 , 制 备 反 应 细 胞 悬 液（可高度纯化，但其中的辅助细胞并不影响实验结果）。
5 . 每孔加 入 200ul预 冷 的 P B S 洗涤上述抗体包被的培养板孔，在超净台中将培养板反转倒扣于吸水纸上轻拍，除去残余的液体，重 复 洗 涤 2 或 3 次 ，确保除去多余的抗体。
6 . 在洗好的板中加入准备好的细胞悬液2 X 105 个细胞/ (0.2 ml •孔）（根据经验来确定 ，不能用杂交瘤上清）。如果细胞暂时未准备好，可 加 100M P B S 后 置 4°C 保存过夜（加细胞前应去掉P B S )。
7 . 按基本方案1 中的步骤7〜9 进 行 ，在 培 养 2〜3d 后（进行动力学实验确定最佳时间）加入3H TdR。
备选方案 2 混合淋巴细胞增殖实验
附 加 材 料
辅助方案1 从抗原呈递细胞或刺激细胞悬液中剔除T 淋巴细胞
这一方法的主要目的是排除辅助T 细胞的影响。纯化和富集抗原呈递细胞的方法见相关章节；单 元 2. 3 中介绍的方法未剔除T 细胞，因此不推荐使用。
附 加 材 料（其 他 材料 见 基 本 方案 1）
与反 应 T 细胞同基因的未免疫小鼠脾细胞
H B S S
低 毒 兔 补 体（Cedarlane) ，用冰冷无菌的去离子水稀释
抗 Thy-l.2单 抗（H 〇 -13-4， A T C C n o . TIB9 9 ) 或 抗 T h y-l.l 单 抗（H 〇 -22-l ，A T C C n o . TIB1 0 0 ; 或其他抗-Thy-I 单 克 隆 抗 体 见 C P I M 表 3. 4. 1 和腹水制
辅助方案2 辅助/刺激细胞的灭活
注 ：当 需 要 检 测 基 因 编 码 的 抗 原 性 差 异 或 没 有 辐 射 射 源 时 ，多数研究者优先采用丝裂霉素 C 灭活细胞。
丝裂霉素C 灭活细胞
附 加 材 料
细胞维持抗原呈递功能； 1100〜2000rad辐射后，抗原呈递能力大幅度下降；> 2 0 0 0 m d灭 活 的 B 细胞失去 A P C 功能。而另一方面，巨噬细胞和树突细胞在 3000rad 照射后依然保持抗原呈递的功能。为 确 保 B 细胞不参与应答，一些研究者倾向于采用 2000rad。然而，在检测刺激细胞 M l s 位点抗原时，应采用< 1000m d 的辐射，因 为 此 时 B 细胞能够更为有效地呈递 M l s 抗原。另外 ， M l s 应答也可在丝裂霉素C 处理后进行检测，处理 后 的 B 细胞依然保持抗原呈递的功能。
在转化的细胞株用作抗原呈递或辅助细胞时，需使用高强度的照射从而阻断其增殖 。每种细胞株适合的辐射强度需要根据预实验来确定，但 至 少 应 达 5000rad; 某些转化的细胞株可能需要高达 10 〇〇〇〜20 OOOrad，或 有 些 细 胞 株 可 能 对 丝 裂 霉 素 C 更为敏感。
基本方案2 致敏T 细胞的活化
材 料
在 第 4 天 或 第 5 天达到髙峰）。
基本方案 3 C D 4+C D 25+T 细胞的活化和抑制功能的检测
材 料
备选方案 3 C D 4+C D 25+T 细胞抑制功能的两步法检测：短期活化和扩增
C D 4+C D 25+T 细胞并分析其抑制功能
附 加 材 料
实验步骤
基 本 方 案 1 未 致 敏 T 淋巴细胞的活化
材 料
备选方案1 用抗体激活未致敏的T 细胞
这种方法适用于当抗C D 3/T C R 复合物抗体不能有效结合小鼠辅助细胞上的F c 受体 ，或其可溶形式不能有效活化T 细胞时。值得注 意 的 是 ，在 某 种 抗 体（如 抗 G 7、Thy-I 单克隆抗体）很难诱导T 细胞增殖反应的情况下，推荐采用基本方案1。
附 加 材 料
P B S (室温和 4°C )
用 P B S 配 制 lm g /m l 纯化的抗C D 3 或 抗 T C R 单 克 隆 抗 体（非特异性活化T 细胞)或 lmg/m l 纯 化 的 抗 V 卩或抗T C R -y S 单 克 隆 抗 体（特 异 性 激 活 T 细胞 ，表
2.11.1)
1.在 4 ml聚苯乙烯圆锥底离心管中，用 无 菌 室 温 PBS (不含蛋白质）将 lmg/ml无菌的 单 克 隆 抗 体 储 存 液（表 2.11.1)，根 据 实 验 需 要 配 制 4 个 浓 度 的 工 作 液 ：如lOOug/ml、 10ug/ml、 1ug/ml、 O.lug/ml， 临用前配制。
2 .加 30ul各浓度的抗体工作液（每孔最多结合2〜3 ug ; 最佳浓度通常为10ug/ml) 至9 6 孔 圆 底 板 中（每种单抗使用一行），用 30/xl P B S 作为对照孔。
3 . 盖好板盖，轻拍培养板侧面确保液体完全覆盖孔底。 37°C 培 养 90 min，或 者 4°C 培养过夜。培养的同时进行下一步操作。
4 . 同基本方案1 中的步骤1〜3 , 制 备 反 应 细 胞 悬 液（可高度纯化，但其中的辅助细胞并不影响实验结果）。
5 . 每孔加 入 200ul预 冷 的 P B S 洗涤上述抗体包被的培养板孔，在超净台中将培养板反转倒扣于吸水纸上轻拍，除去残余的液体，重 复 洗 涤 2 或 3 次 ，确保除去多余的抗体。
6 . 在洗好的板中加入准备好的细胞悬液2 X 105 个细胞/ (0.2 ml •孔）（根据经验来确定 ，不能用杂交瘤上清）。如果细胞暂时未准备好，可 加 100M P B S 后 置 4°C 保存过夜（加细胞前应去掉P B S )。
7 . 按基本方案1 中的步骤7〜9 进 行 ，在 培 养 2〜3d 后（进行动力学实验确定最佳时间）加入3H TdR。
备选方案 2 混合淋巴细胞增殖实验
附 加 材 料
辅助方案1 从抗原呈递细胞或刺激细胞悬液中剔除T 淋巴细胞
这一方法的主要目的是排除辅助T 细胞的影响。纯化和富集抗原呈递细胞的方法见相关章节；单 元 2. 3 中介绍的方法未剔除T 细胞，因此不推荐使用。
附 加 材 料（其 他 材料 见 基 本 方案 1）
与反 应 T 细胞同基因的未免疫小鼠脾细胞
H B S S
低 毒 兔 补 体（Cedarlane) ，用冰冷无菌的去离子水稀释
抗 Thy-l.2单 抗（H 〇 -13-4， A T C C n o . TIB9 9 ) 或 抗 T h y-l.l 单 抗（H 〇 -22-l ，A T C C n o . TIB1 0 0 ; 或其他抗-Thy-I 单 克 隆 抗 体 见 C P I M 表 3. 4. 1 和腹水制
辅助方案2 辅助/刺激细胞的灭活
注 ：当 需 要 检 测 基 因 编 码 的 抗 原 性 差 异 或 没 有 辐 射 射 源 时 ，多数研究者优先采用丝裂霉素 C 灭活细胞。
丝裂霉素C 灭活细胞
附 加 材 料
细胞维持抗原呈递功能； 1100〜2000rad辐射后，抗原呈递能力大幅度下降；> 2 0 0 0 m d灭 活 的 B 细胞失去 A P C 功能。而另一方面，巨噬细胞和树突细胞在 3000rad 照射后依然保持抗原呈递的功能。为 确 保 B 细胞不参与应答，一些研究者倾向于采用 2000rad。然而，在检测刺激细胞 M l s 位点抗原时，应采用< 1000m d 的辐射，因 为 此 时 B 细胞能够更为有效地呈递 M l s 抗原。另外 ， M l s 应答也可在丝裂霉素C 处理后进行检测，处理 后 的 B 细胞依然保持抗原呈递的功能。
在转化的细胞株用作抗原呈递或辅助细胞时，需使用高强度的照射从而阻断其增殖 。每种细胞株适合的辐射强度需要根据预实验来确定，但 至 少 应 达 5000rad; 某些转化的细胞株可能需要高达 10 〇〇〇〜20 OOOrad，或 有 些 细 胞 株 可 能 对 丝 裂 霉 素 C 更为敏感。
基本方案2 致敏T 细胞的活化
材 料
在 第 4 天 或 第 5 天达到髙峰）。
基本方案 3 C D 4+C D 25+T 细胞的活化和抑制功能的检测
材 料
备选方案 3 C D 4+C D 25+T 细胞抑制功能的两步法检测：短期活化和扩增
C D 4+C D 25+T 细胞并分析其抑制功能
附 加 材 料
