细 胞 毒 性 T 淋 巴 细 胞 的 诱 导 及 检 测
实验原理
基 本 方 案 1 从 C TL 前体中诱导细胞毒性
注意：反应细胞应根据抗原的种类选择是否需要进行体内致敏。
材 料
反应细胞来源：未致敏的或者体内致敏的小鼠脾脏细胞（见辅助方案 1 和 2
致敏培养基
刺激细胞来源：未修饰或半抗原修饰的小鼠脾脏细胞（见辅助方案 3)
R P M I -1 0 完全培养基
H B S S 溶 解 的 0.5m g / m l 丝裂霉素 C (避光保存）
刀豆蛋白 A (选用）：以 or 甲基-D -甘露糖苷中和后加上清至培养细胞中
IL-2 (选用）
带有旋盖的 15 ml —次性聚苯乙烯圆锥管（如 Falcon)
2 4 孔平底微量滴定板， 2m l 容积，带 盖 子（如 Costar)
注 ：实验小鼠应避免影响实验结果的感染，如 m y c o p l a s m a 和 免 疫 抑 制 性 病 毒（如
基本方案 2 络释放法分析 CTL 活性
材 料
辅 助 方 案 1 次要组织相容性抗原的小鼠体内应答
为在体内产生针对次要组织相容性抗原的应答，应 采 用 与 供 者 小 鼠 品 系 相 同 H -2并且同性的小鼠作为受者。为产生抗 H -Y 反 应（次要抗原的一个特例），采用雌性受者和同品系雄性小鼠的皮肤或细胞。
向受者小鼠移植皮肤或腹腔注射 IX IO7〜5 X IO7 个 脾 脏 细 胞（在 0. 1〜0. 5 ml 体积内；附 录 2E ) ，与 单 元 1 .2 中的方法制备的弗氏完全佐剂形成乳浊液。用无血清培养基
稀释细胞注射小鼠。在某些品系之间，可能需要在 10〜Md 后再次注射 IO7 个脾脏细胞以产生强烈的体外再次应答。在通过适当途径进行体内免疫后，按 诱 导 C T L (见基本方 案 1 ) 的方法制备脾脏单细胞悬液。对于再次应答，提供反应细胞的小鼠通常在最短1 周 最 长 1 年的时间内进行过体内免疫。
辅 助 方 案 2 病毒抗原体内免疫小鼠
将流感病毒尿囊储存液用 1.0 ml P B S 稀 释 至 300 血 凝 素 单 位（H A U )。按 附 录 2E的方法进行腹腔注射。采用适当的途径进行体内免疫后，收集细胞，按 诱 导 C T L (见基本 方 案 1 ) 的方法制备脾脏单细胞悬液。
抗 原 修 饰 刺 激 细 胞 和 靶 细 胞
在 51C r 释放实验中最好用活化细胞作为靶细胞，而正常脾脏细胞可用来刺激产生C T L (这样可以避免耗时的活化步骤。）
辅助方案 3 T N P 修饰靶/刺激细胞
材 料
辅助方案 4 病毒感染靶/刺激细胞
材 料（其他材料见基本方案 2 )
不 考 虑 抗 原 特 异 性 的 总 C T L 活 性 评 价
下面的方案通过釆用有丝分裂原刺激 C T L 前体的方法绕过 M H C 限制性和 C T L 前体的抗原特异性。
备选方案 1 多克隆 C T L 活性的诱导
在 2 4 孔 微 滴 定 板 中 用 含 有 恥 2ug/ml C o n A 的 致 敏 培 养 基 培 养 反 应 脾 脏 细 胞
实验步骤
基 本 方 案 1 从 C TL 前体中诱导细胞毒性
注意：反应细胞应根据抗原的种类选择是否需要进行体内致敏。
材 料
反应细胞来源：未致敏的或者体内致敏的小鼠脾脏细胞（见辅助方案 1 和 2
致敏培养基
刺激细胞来源：未修饰或半抗原修饰的小鼠脾脏细胞（见辅助方案 3)
R P M I -1 0 完全培养基
H B S S 溶 解 的 0.5m g / m l 丝裂霉素 C (避光保存）
刀豆蛋白 A (选用）：以 or 甲基-D -甘露糖苷中和后加上清至培养细胞中
IL-2 (选用）
带有旋盖的 15 ml —次性聚苯乙烯圆锥管（如 Falcon)
2 4 孔平底微量滴定板， 2m l 容积，带 盖 子（如 Costar)
注 ：实验小鼠应避免影响实验结果的感染，如 m y c o p l a s m a 和 免 疫 抑 制 性 病 毒（如
基本方案 2 络释放法分析 CTL 活性
材 料
辅 助 方 案 1 次要组织相容性抗原的小鼠体内应答
为在体内产生针对次要组织相容性抗原的应答，应 采 用 与 供 者 小 鼠 品 系 相 同 H -2并且同性的小鼠作为受者。为产生抗 H -Y 反 应（次要抗原的一个特例），采用雌性受者和同品系雄性小鼠的皮肤或细胞。
向受者小鼠移植皮肤或腹腔注射 IX IO7〜5 X IO7 个 脾 脏 细 胞（在 0. 1〜0. 5 ml 体积内；附 录 2E ) ，与 单 元 1 .2 中的方法制备的弗氏完全佐剂形成乳浊液。用无血清培养基
稀释细胞注射小鼠。在某些品系之间，可能需要在 10〜Md 后再次注射 IO7 个脾脏细胞以产生强烈的体外再次应答。在通过适当途径进行体内免疫后，按 诱 导 C T L (见基本方 案 1 ) 的方法制备脾脏单细胞悬液。对于再次应答，提供反应细胞的小鼠通常在最短1 周 最 长 1 年的时间内进行过体内免疫。
辅 助 方 案 2 病毒抗原体内免疫小鼠
将流感病毒尿囊储存液用 1.0 ml P B S 稀 释 至 300 血 凝 素 单 位（H A U )。按 附 录 2E的方法进行腹腔注射。采用适当的途径进行体内免疫后，收集细胞，按 诱 导 C T L (见基本 方 案 1 ) 的方法制备脾脏单细胞悬液。
抗 原 修 饰 刺 激 细 胞 和 靶 细 胞
在 51C r 释放实验中最好用活化细胞作为靶细胞，而正常脾脏细胞可用来刺激产生C T L (这样可以避免耗时的活化步骤。）
辅助方案 3 T N P 修饰靶/刺激细胞
材 料
辅助方案 4 病毒感染靶/刺激细胞
材 料（其他材料见基本方案 2 )
不 考 虑 抗 原 特 异 性 的 总 C T L 活 性 评 价
下面的方案通过釆用有丝分裂原刺激 C T L 前体的方法绕过 M H C 限制性和 C T L 前体的抗原特异性。
备选方案 1 多克隆 C T L 活性的诱导
在 2 4 孔 微 滴 定 板 中 用 含 有 恥 2ug/ml C o n A 的 致 敏 培 养 基 培 养 反 应 脾 脏 细 胞
