采 用 细 胞 内 荧 光 染 料 CFSE检 测 淋 巴 细 胞 的 迁 移 和 增 殖
实验原理
基 本 方 案 淋 巴 细 胞 的 CFSE 标记
材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)
实验动物，人外周血或者培养的淋巴细胞
VPBS, pH7. 4
H a n k s 平 衡 盐 溶 液（H B S S ) p H 7. 4
含 5 % (V /V ) 热 灭 活 F B S 的 P B S
5m m o l / L C F S E 储存液
0.5 m o l / L E D T A 的 P B S 溶 液（用于培养的淋巴细胞）
实验所需的抗原和有丝分裂原
I Oml 塑 料 管（选用）
配备荧光滤片的荧光显微镜
注 ：细胞标记 C F S E 后不能马上检测，因为这时的荧光强度极髙。细胞摄入的大部分 C F S E 尚不稳定，在随后的几天内会逐渐丢失。
la. 细胞数较多时：用 附 录 2 H 、单 元 2. 1 和 单 元 8. 1 中介绍的方法制备淋巴细胞，人P B M C 用 PBS (无血清）混悬至 5 0 X 106 个细胞/m l ，小鼠淋巴细胞用 H B S S (无血清）混悬至相同浓度。
lb. 细胞数量较少时：用 含 5 % F B S 的 PBS (蛋白质可减弱 C F S E 的毒性）混悬新鲜分离的淋巴细胞，使浓度为〇• 5 X 106〜IOXlO6 个细胞/ml 。
lc. 培养的淋巴细胞：不要离心静息的淋巴细胞。将标记试剂直接加在含 1 0 % F B S 的培养基中。
2 . 用 P B S 将 5m m o l /L C F S E 储存液按 1 / 1 0 0 比 例 稀 释（50 Mmol/L 浓度）。每毫升细胞悬液中加入 110ul 上述溶液并迅速混匀。例如，将细胞悬液加入 IOml 塑料管，保持塑料管竖直，将 C F S E 加在管壁干燥的部分。保持竖直的塑料管盖上盖子后迅速颠倒几次混匀。或者一边振摇细胞一边加入等体积的预先稀释至 lOumol/L 的 C F S E 。
如果上述方法用于大量细胞，应将淋巴细胞浓度从 5 0 X 106 个细胞/m l 提 高 至 1 0 0 XIO6 个细胞/m l 。如果计划在 24 h 以内检测 C F S E 标记的细胞，应采用常用 C F S E 浓度 的 1/4 或 1/8 进行标记。
3a 分 离 的 淋 巴 细 胞 ：室温孵育 5min 后，加 入 1 0 倍 体 积 的 含 5 % FBS 的 PBS,20℃，300 g 离 心 5min,弃 上 清 。洗 3 遍 ，每 遍 加 入 1 0 倍 体 积 的 5 % F B S 的 P B S ，2 〇 °C ， 30 〇 g 离 心 5 min，弃上清。
3b. 培养的淋巴细胞：用 P B S 洗 涤 过 后 加 入 0.5 mmol/L E D T A 的 P B S 溶 液 孵 育 5 min去除团块。再 用 P B S 洗一遍后用培养基混悬备用。
4 . 将 C F S E 标记的淋巴细胞用不含蛋白质（无血清）的组织培养基混悬后静脉注射（i.v . ) 至受者动物体内。如实验对象为小鼠，则 将 I X l O 6〜40 X 106 个 细 胞 在 0 . 1〜
0.2 m l 的液体中注入尾静脉（注射超过 50 X 106 个细胞会使小鼠淋巴器官达到饱和；在此饱和点之前注射细胞数与进入淋巴器官的细胞数呈线性关系）。
通过采用不同的 C F S E 标记浓度可以同时追踪两种不同的淋巴细胞群体。一群细 胞 以 5u m o l / L 的 C F S E 标 记（步 骤 I a 和 I b ) ， 另 一 群 以 常 用 农 度 的 1/4(1.25;xmol/L ) 或 1/16 (0.312jumol/L ) 进行标记。
24 h 内检测过继到动物体内的细胞时，为避免流式细胞仪上出现超出检测范围的荧光强度，应采用常用浓度的 1/4 (1.25umol/L 或 1/8 (0.625 Umol/L ) 进行标记（步 骤 1 和 2)。
5 . 用带滤光片的荧光显微镜观察淋巴器官和其他组织中 C F S E 标记细胞的位置，或采用 焚 光 素 的 特 异 性 抗 体 进 行 免 疫 组 织 化 学 检 测（Garton and Schoenwolf， 1996;Graziano 衫 aZ.， 1998)。用荧光显微镜观察 C F S E 标记的细胞时，取出动物器官，切成 约 3m m 的薄片，放于载玻片上观察。
在荧光显微镜下观察会让 C F S E 荧光迅速泮灭，用传统组织学染色会使其完全泮灭。如需较低解像度进行短时间定位分析，推 荐 使 用 H 33342 (Parish， 1999)。如需较高解像度定位研究，推 荐 用 组 织 切 片 的 免 疫 组 织 化 学 方 法 检 测 C F S E 标记细胞。
6 . 用 培 养 基 混 悬 C F S E 标 记 的 细 胞 ，在 体 外 用 抗 原 或 有 丝 分 裂 原 刺 激（单 元 2. 7、2. 11、 8. 8 、 8. 9)0
7a. 获取体内细胞：收集淋巴器官，制 成 单 细 胞 悬 液（附 录 2 H 和 单 元 2.1)。
7b. 收获同一种体外培养细胞：收集培养细胞，用 3m l P B S 洗一遍，用 2m l 0. 5 mmol/LE D T A /P B S 混悬， 37 〇 C 孵 育 5m i n 分解细胞团块。 20oC ， 300 g 离 心 5 min，用 含 5 %F B S 的 P B S 混悬细胞后转移至流式管中。如果需要用血细胞计数板进行人工计数(附录 3A )，取少量细胞悬液放在另一个离心管中或 V 底板中置冰上保存。
7c. 收获多种体外培养细胞：从 9 6 孔平底板中收集细胞时，吸取适量上清后将三孔细胞 转 移 至 96 孔 V 底板的一个孔中。采 用 步 骤 7b 的方法 加 入 150M1 E D T A 洗一遍。在培养板架上 300 g 离 心 2 min。用移液器沿孔壁由上向下吸取上清，直到枪头的尖端到达垂直管壁和 V 形底的交界处。在振荡器上振动培养板混勻细胞，随后用多通道移液器加入下一步洗涤试剂。
辅 助 方 案 流 式 细 胞 仪 分 析 CFSE 标记的细胞
本方案总结了对 C F S E 标记细胞的增殖进行定量分析的实验步骤。关于流式细胞分析的更多信息参见第四章。
材料
C F S E 标 记 的 细 胞（见基本方案）
能检测三色荧光的流式细胞分析仪
流 式 细 胞 分 选 仪（选用）
1 . 根据实验需要对细胞进行流式标记（例 如 ，细胞表面标记，单 元 4 . 1 ; 胞内细胞因子染色，单 元 5. 8 ; 碘化丙锭染色分析细胞凋亡，单 元 2. 14)。进 行 流 式 细 胞 分 析（单元 4. 2)。
对于软件分析
2a. 用 合 适 的 软 件（如 Quantumsoft’s Profit、 SPSS Science’s Peakfit、 Verity SoftwareHouse’s ModFit、 Science Speak，s C F S E Modeler) 对 C F S E 峰值进行分析。
对于人工计算
2b. 记 录 C F S E 标记的对照细胞，以及未标记的对照组和刺激组细胞荧光强度的几何均数（未标记的增殖细胞的自发荧光要高于未标记的对照不增殖细胞）。
3b. 从 C F S E 标 记 的 对 照 细 胞 荧 光 强 度 几 何 均 数 中 减 去 相 应 的 未 标 记 细 胞 对 照（如600-2 = 598)。将所得数值换算成 1 0 的 对 数（本 例 为 2.776)。
4b. 确定子代细胞的几何平均荧光强度。子代细胞荧光强度为不增殖细胞荧光峰值的1/2、 1/4……以此类推，所以每分裂一次荧光强度减去 0.3logl0 。
细胞频率的局限性在于，只能在分裂细胞荧光强度与未刺激细胞的自发焚光重叠之前进行分析。
实验步骤
基 本 方 案 淋 巴 细 胞 的 CFSE 标记
材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)
实验动物，人外周血或者培养的淋巴细胞
VPBS, pH7. 4
H a n k s 平 衡 盐 溶 液（H B S S ) p H 7. 4
含 5 % (V /V ) 热 灭 活 F B S 的 P B S
5m m o l / L C F S E 储存液
0.5 m o l / L E D T A 的 P B S 溶 液（用于培养的淋巴细胞）
实验所需的抗原和有丝分裂原
I Oml 塑 料 管（选用）
配备荧光滤片的荧光显微镜
注 ：细胞标记 C F S E 后不能马上检测，因为这时的荧光强度极髙。细胞摄入的大部分 C F S E 尚不稳定，在随后的几天内会逐渐丢失。
la. 细胞数较多时：用 附 录 2 H 、单 元 2. 1 和 单 元 8. 1 中介绍的方法制备淋巴细胞，人P B M C 用 PBS (无血清）混悬至 5 0 X 106 个细胞/m l ，小鼠淋巴细胞用 H B S S (无血清）混悬至相同浓度。
lb. 细胞数量较少时：用 含 5 % F B S 的 PBS (蛋白质可减弱 C F S E 的毒性）混悬新鲜分离的淋巴细胞，使浓度为〇• 5 X 106〜IOXlO6 个细胞/ml 。
lc. 培养的淋巴细胞：不要离心静息的淋巴细胞。将标记试剂直接加在含 1 0 % F B S 的培养基中。
2 . 用 P B S 将 5m m o l /L C F S E 储存液按 1 / 1 0 0 比 例 稀 释（50 Mmol/L 浓度）。每毫升细胞悬液中加入 110ul 上述溶液并迅速混匀。例如，将细胞悬液加入 IOml 塑料管，保持塑料管竖直，将 C F S E 加在管壁干燥的部分。保持竖直的塑料管盖上盖子后迅速颠倒几次混匀。或者一边振摇细胞一边加入等体积的预先稀释至 lOumol/L 的 C F S E 。
如果上述方法用于大量细胞，应将淋巴细胞浓度从 5 0 X 106 个细胞/m l 提 高 至 1 0 0 XIO6 个细胞/m l 。如果计划在 24 h 以内检测 C F S E 标记的细胞，应采用常用 C F S E 浓度 的 1/4 或 1/8 进行标记。
3a 分 离 的 淋 巴 细 胞 ：室温孵育 5min 后，加 入 1 0 倍 体 积 的 含 5 % FBS 的 PBS,20℃，300 g 离 心 5min,弃 上 清 。洗 3 遍 ，每 遍 加 入 1 0 倍 体 积 的 5 % F B S 的 P B S ，2 〇 °C ， 30 〇 g 离 心 5 min，弃上清。
3b. 培养的淋巴细胞：用 P B S 洗 涤 过 后 加 入 0.5 mmol/L E D T A 的 P B S 溶 液 孵 育 5 min去除团块。再 用 P B S 洗一遍后用培养基混悬备用。
4 . 将 C F S E 标记的淋巴细胞用不含蛋白质（无血清）的组织培养基混悬后静脉注射（i.v . ) 至受者动物体内。如实验对象为小鼠，则 将 I X l O 6〜40 X 106 个 细 胞 在 0 . 1〜
0.2 m l 的液体中注入尾静脉（注射超过 50 X 106 个细胞会使小鼠淋巴器官达到饱和；在此饱和点之前注射细胞数与进入淋巴器官的细胞数呈线性关系）。
通过采用不同的 C F S E 标记浓度可以同时追踪两种不同的淋巴细胞群体。一群细 胞 以 5u m o l / L 的 C F S E 标 记（步 骤 I a 和 I b ) ， 另 一 群 以 常 用 农 度 的 1/4(1.25;xmol/L ) 或 1/16 (0.312jumol/L ) 进行标记。
24 h 内检测过继到动物体内的细胞时，为避免流式细胞仪上出现超出检测范围的荧光强度，应采用常用浓度的 1/4 (1.25umol/L 或 1/8 (0.625 Umol/L ) 进行标记（步 骤 1 和 2)。
5 . 用带滤光片的荧光显微镜观察淋巴器官和其他组织中 C F S E 标记细胞的位置，或采用 焚 光 素 的 特 异 性 抗 体 进 行 免 疫 组 织 化 学 检 测（Garton and Schoenwolf， 1996;Graziano 衫 aZ.， 1998)。用荧光显微镜观察 C F S E 标记的细胞时，取出动物器官，切成 约 3m m 的薄片，放于载玻片上观察。
在荧光显微镜下观察会让 C F S E 荧光迅速泮灭，用传统组织学染色会使其完全泮灭。如需较低解像度进行短时间定位分析，推 荐 使 用 H 33342 (Parish， 1999)。如需较高解像度定位研究，推 荐 用 组 织 切 片 的 免 疫 组 织 化 学 方 法 检 测 C F S E 标记细胞。
6 . 用 培 养 基 混 悬 C F S E 标 记 的 细 胞 ，在 体 外 用 抗 原 或 有 丝 分 裂 原 刺 激（单 元 2. 7、2. 11、 8. 8 、 8. 9)0
7a. 获取体内细胞：收集淋巴器官，制 成 单 细 胞 悬 液（附 录 2 H 和 单 元 2.1)。
7b. 收获同一种体外培养细胞：收集培养细胞，用 3m l P B S 洗一遍，用 2m l 0. 5 mmol/LE D T A /P B S 混悬， 37 〇 C 孵 育 5m i n 分解细胞团块。 20oC ， 300 g 离 心 5 min，用 含 5 %F B S 的 P B S 混悬细胞后转移至流式管中。如果需要用血细胞计数板进行人工计数(附录 3A )，取少量细胞悬液放在另一个离心管中或 V 底板中置冰上保存。
7c. 收获多种体外培养细胞：从 9 6 孔平底板中收集细胞时，吸取适量上清后将三孔细胞 转 移 至 96 孔 V 底板的一个孔中。采 用 步 骤 7b 的方法 加 入 150M1 E D T A 洗一遍。在培养板架上 300 g 离 心 2 min。用移液器沿孔壁由上向下吸取上清，直到枪头的尖端到达垂直管壁和 V 形底的交界处。在振荡器上振动培养板混勻细胞，随后用多通道移液器加入下一步洗涤试剂。
辅 助 方 案 流 式 细 胞 仪 分 析 CFSE 标记的细胞
本方案总结了对 C F S E 标记细胞的增殖进行定量分析的实验步骤。关于流式细胞分析的更多信息参见第四章。
材料
C F S E 标 记 的 细 胞（见基本方案）
能检测三色荧光的流式细胞分析仪
流 式 细 胞 分 选 仪（选用）
1 . 根据实验需要对细胞进行流式标记（例 如 ，细胞表面标记，单 元 4 . 1 ; 胞内细胞因子染色，单 元 5. 8 ; 碘化丙锭染色分析细胞凋亡，单 元 2. 14)。进 行 流 式 细 胞 分 析（单元 4. 2)。
对于软件分析
2a. 用 合 适 的 软 件（如 Quantumsoft’s Profit、 SPSS Science’s Peakfit、 Verity SoftwareHouse’s ModFit、 Science Speak，s C F S E Modeler) 对 C F S E 峰值进行分析。
对于人工计算
2b. 记 录 C F S E 标记的对照细胞，以及未标记的对照组和刺激组细胞荧光强度的几何均数（未标记的增殖细胞的自发荧光要高于未标记的对照不增殖细胞）。
3b. 从 C F S E 标 记 的 对 照 细 胞 荧 光 强 度 几 何 均 数 中 减 去 相 应 的 未 标 记 细 胞 对 照（如600-2 = 598)。将所得数值换算成 1 0 的 对 数（本 例 为 2.776)。
4b. 确定子代细胞的几何平均荧光强度。子代细胞荧光强度为不增殖细胞荧光峰值的1/2、 1/4……以此类推，所以每分裂一次荧光强度减去 0.3logl0 。
细胞频率的局限性在于，只能在分裂细胞荧光强度与未刺激细胞的自发焚光重叠之前进行分析。
