基 本 方 案 1 用 AUTOMACS 系 统 进行 总 T 细胞、 CD4 ⁺ 细 胞 或 CD8⁺T细胞的自动分离

材 料

小鼠

HBSS 洗涤缓冲液

基 本 方 案 2 使 用 AUTOMACS 系 统 进 行 B 细胞的自动分选

材 料

小鼠

HBSS 洗涤缓冲液

MACS 缓冲液

CD45R (B2 2 0 ) 磁 珠（Miltenyi)

RPMI-10 完全培养基

autoMACS 系 统 和 分 选 柱（Miltenyi)

30um 尼 龙 网（BD) 或 40/xm 预 分 离 滤 膜（Miltenyi)

1 . 用 2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞（单 元 2.1)。

2.将细胞在 10 ml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数（附 录 3A)。

3.将细胞悬液在 4℃， 20og离心 10min。弃上清后将沉淀按每 10⁸ 个细胞 0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每 10⁸ 个细胞加入 0.1ml CD45R(B220) 磁珠后在 4℃孵育 15 min

4.按基本方案 1 中的步骤 4〜7 操作，这样 B 细胞将从阳性通道洗脱。

基 本 方 案 3 使 用 AUTOMACS 系统进行辅助细胞的自动分选

材 料
小鼠

HBSS 洗涤缓冲液

MACS 缓冲液

CD90 (Thyl.2 ) 磁 珠（Miltenyi)

RPMI-IO 完全培养基

autoMACS 系统和分选柱（Miltenyi)

30um 尼 龙 网（BD) 或 40um 预分离滤膜（Miltenyi)

1.用 2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞（单元 2.1)。

2.将细胞在 IOml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数（附录 3A)。

3.将细胞悬液在 4°C， 200 g 离心 lOmin。弃上清后将沉淀按每 IO8 个细胞 0. 9 mlMACS缓冲液的比例混悬。每 1 〇 ⁸ 个细胞加入0.1ml CD90 (Thy1.2) 磁珠后在 4℃孵育 15 min

4.除了选择 depletes 程 序（非 possel 程序），其他操作按基本方案 1 中的步骤 4〜7 进行，这样辅助细胞将从阴性通道洗脱。

备 选 方 案 1 用磁性分选柱手工操作分离淋巴细胞

附 加 材 料（其 他 材 料 见 基 本 方 案 1 )

不含气体的 MACS 缓冲液， 4°C (在上样和洗柱过程中保持冰冷）

Midi MACS 分离磁铁、 MACS 多用支架、 LS 或 LD 分 选 （Miltenyi)

15 ml 离心管，无菌

la. 对于分离总 T 细胞， CD4⁺ T 细胞或 CD8⁺ T 细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬 液（见基本方案 1， 1〜3 步）。

lb. 对于分离 B 细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬液（见基本方案 2 , 步骤 1〜3)。

lc. 对于分离辅助细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬液（见基本方案 3 , 步骤1〜3

2.将细胞悬液在 4°C， 200 g 离心 lOmin。

3.离心期间，将 Midi MACS 分离磁铁安装到 MACS 多用支架上，并将 LS 分选柱（用于分离总 T 细胞、 CD4+T 细胞、 CD8+T 细胞或 B 细胞）或 LD 柱（用于分离辅助细胞）放到磁体中，在分选柱下放一支无菌的 15 ml 离心管。用 4°C 不含气体的 MACS缓冲液冲洗分选柱 3 次，每次 3 ml。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支干净的无菌离心管。

基 本 方 案 4 用 AUTOMACS 系统自动 分 选 CD4 +CD2 5+ 抑制性细胞

由此方法得到的阴性细胞（CD4⁺CD2 5^- ) 可用作反应细胞或对照细胞。

备 选 方 案 2 用磁性分选柱手工操作分离 CD4 +CD25+抑制性细胞

附 加 材 料（其 他 材 料 见 基 本 方 案 4)
不含气体的 MACS 缓冲液， 4°C (在上样和洗柱过程中保持冰冷）

Midi MACS 分 离 磁 铁（Miltenyi)

MACS 多 用 支 架（Miltenyi)

LD 分 选 柱（Miltenyi)