实验方法

质谱在蛋白质组学中的应用实验

难度系数: 暂无得分

收藏

电泳胶分离的蛋白质质谱(MS) 鉴定方法是蛋白质组学的基本技术平台。事实上,由于质谱的灵敏度更高、能处理混合蛋白样品,并且具有更高的样品通量,所以它基本上取代了 Edman 降解法这一蛋白质鉴定的经典技术。目前以质谱为基础的蛋白质组策略基本上是利用有序列特异性的蛋白酶,对一维(1D) 凝胶或者二维(2D) 凝胶分离的蛋白进行凝胶原位酶解,使之成为肽段。

方案1 蛋白质和多肽 MALDI-MS 分析的一般方法

实验原理

1.吸取 0.5ul 的基质溶液,加到 MALDI-MS 分析所用的金属样品板上的样品孔中(为了准确起见,请使用2ul 的移液器)。

2.在基质干燥之前,迅速加入 0.5ul 的标准品或样品到基质中。

3.置于室温条件或 40℃ 的烘箱内约 5 min,让溶剂蒸发以使样品干燥。

4.把金属板转移到质谱仪的真空舱内。

5.以恰好高于离子化阈值的激光能量来「预热」校准标准品,从而获得初始质量图谱。

6.然后,降低激光能量直到获得高质量的图谱。

7.用适合的校准物来获得线性的两点(two—point) 外标校准(参考表 8.9 和表 8.10)

8.对未知样品重复步骤 5 和步骤 6, 并与校准值相比较以获得精确的质量。

9.使用完毕后,用水彻底冲洗 MALDI 板以除去任何可见的晶体,然后再用无棉绒薄纸(例如,Kimwipes 纸)沾甲醇擦拭。

实验材料

冷冻干燥样品

仪器/耗材

MALDI 质谱仪 MALDI 板

实验步骤

1.吸取 0.5ul 的基质溶液,加到 MALDI-MS 分析所用的金属样品板上的样品孔中(为了准确起见,请使用2ul 的移液器)。

2.在基质干燥之前,迅速加入 0.5ul 的标准品或样品到基质中。

3.置于室温条件或 40℃ 的烘箱内约 5 min,让溶剂蒸发以使样品干燥。

4.把金属板转移到质谱仪的真空舱内。

5.以恰好高于离子化阈值的激光能量来「预热」校准标准品,从而获得初始质量图谱。

6.然后,降低激光能量直到获得高质量的图谱。

7.用适合的校准物来获得线性的两点(two—point) 外标校准(参考表 8.9 和表 8.10)

8.对未知样品重复步骤 5 和步骤 6, 并与校准值相比较以获得精确的质量。

9.使用完毕后,用水彻底冲洗 MALDI 板以除去任何可见的晶体,然后再用无棉绒薄纸(例如,Kimwipes 纸)沾甲醇擦拭。