干细胞向成体动物体内移植—NOD/SCID 小鼠造血干/祖细胞移植

基 本 原 理

S C I D 小鼠为一种先天性 T 、B 细胞双重免疫缺陷动物。S C I D 小鼠由美国学者 Bosma1983 年首先发现于 C.B /17 近交系小鼠，是 由 位 于 16 号 染 色 体 的 隐 性 基 因 突 变 所 致 。纯 合 基 因 突 变 导 致 了 淋 巴 细 胞 抗 原 受 体 基 因 V 、 D 、 J编码的重组酶活性异常，使抗原 受 体基因 V 、 D 、J不能正常重排， T 、 B 淋巴细胞不能分化为功能性淋巴细胞，使得细胞免疫、体液免疫均缺陷，但该小鼠非淋巴性造血细胞分化不受影响，巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、红细胞、 N K 细胞均呈正常状态，骨髓造血微环境和胸腺基质也正常。另外， 基因突变也影响了该种小鼠的 D N A 修复系统，使其组织器官对电离辐射高度敏感而不能修复 D N A 的断裂。

N O D /S C I D 小鼠是用 S C I D 小鼠与 N O D /LtSz 系非肥胖性糖尿病 (non obese diabetic)小鼠回交产生的后代。它 既 存 在 基 因 突 变 引 起 的 T 、 B 细胞缺乏，又存 在 W O D 突变引 起 的 N K 细胞活性下降，补体和巨噬细胞功能缺陷， N O D /S C I D 小 鼠 比 S C I D 小鼠残留的免疫功能更少。而 且 N O D /S C I D 小鼠因为*SC/Z) 突变缺乏 T 细 胞 和 B 细胞免疫而不会发生自身免疫性糖尿病。因此，利 用 N O D /S C I D 小鼠进行干细胞移植具有完整的免疫缺陷，不易发生免疫排斥，能高效的移植异体干细胞，又有足够长的寿命完成移植后的观测。 N O D /S C I D 小鼠已成为当前干细胞移植、干细胞体内增殖分化研究中最常用的动物模型。其经典的实验莫过于向亚致死剂量照射的 N O D /S C I D 小鼠体内移植入外周血造血干/祖细胞，研究其造血重建功能。

主 要 设 备 与 试 剂

仪 器 设 备

二氧化碳孵箱、荧光倒置显微镜、恒温离心机、 - 7 0℃超低温冰箱、高速低温离心机^ P C R 仪 、流式细胞仪、数码照相机、酶标仪、超净工作台、电泳仪、恒温水槽、台式高速离心机、普通光学显微镜、倒置显微镜、电子分析天平、恒温振荡器、 -20℃ ：卧式低温冰柜、冰冻切片机、组织切片机、钴 源 6 GC o 、微型琼脂糖电泳槽。

主 要 试 剂

P C R 试 剂 盒 和 R T -P C R 试剂盒； 1 〇〇 bp D N A marker 曝呤霉素 (puromycin) ; 聚凝胺(polybrene)C D 45-PerCP/C D 3-FITC/C D 4-P E 三色荧光标记抗体、 C D 3-F I T C 突光标记抗体、
C D 4-P E 突光标记抗体；新霉素、多黏菌素 b 、乳酸环丙沙星； 4 % 多聚甲醛、肝素；磷酸盐缓冲液 P B S ; 分析纯氯仿、无水乙醇、异丙醇、乙醚；电泳用琼脂糖、碘化丙锭 (PI)、溴化乙锭 (E B )。

实 验 动 物

N O D /SCID 小 鼠 ， 6〜 8 周 龄 ，体 重 18——20 g ，雌 性 ；三级动物饲养环境；笼具、垫料、饲料及饮水均高压灭菌，每周更换 2 次。饮水酸化。

操 作 步 骤

动 物 预 处 理
⑴ 照 射 前 准 备 ：照 乳酸环丙沙星〇.lg/L ，至照射后 4 周 ；

(2) 动物照射：细 胞 移 植 前 1 天 ，将小鼠放入经无菌处理的照射盒中，给予总剂量为 2. 5 G y 的 ⁶⁰ C〇-γ全身照射，剂量 率 为 2 〇 cGy/min; 照射结束后无菌条件下将小鼠转入动物房。

造 血 干 细 胞 移 植

⑴ 小 鼠 照 射 后 12〜 2 4 h , 按 照 2xl0⁷ 个/只、
接种经分离纯化的供体造血干细胞；

(2)观察小鼠存活情况，每周测小鼠体重，取尾静脉血，测定小鼠外周血中人CD45⁺ ,CD3⁺ ,CD4⁺ 细胞的比例；

⑶ 移植后 6 周 ，断颈处死小鼠前，取肝脏、脾 、骨髓制备细胞悬液， 4 % 多聚甲醛固定，流式细胞仪检测；4% 多聚甲酵固定液：称取多聚甲酸兔 加 入 腦 〇 ml 的容量瓶中，先 加 入 〇.lmol/LPBS 力 0 ml，放入磁力搅拌棒，加 Na 〇 H 助溶，调 整 容 量 至 腦 誠 ，调 整 p H 至 7. 4 。

外 周 血 流 式 细 胞 仪 检 测 方 法 .

(1) 无菌环境下，每 只 E p 管中分别加入 2 0 ul肝素 (125U /ul) 用于抗凝，经尾静脉取血 5 0 ul ，颠倒混勻；

⑵ 每 只 E p 管中分别加人 1 〇ul 抗 cD45/CD3/CD4 抗体；室温 ，避 光 孵 育 20 min;

(3) 加入红细胞裂解液，室温避光孵育 15 min;

(4) 用 PBS 洗 涤 2 次 ，轻柔重悬，使终体积为 300 ul；

(5) 上机测定。

4各 器 官 细 胞悬 液 制 备 及 流 式 细 胞 仪 检 测 方 法

⑴ 移 植 后 存 活 6 周 的 N O D /S C I D 小鼠经颈椎脱臼法处死后，于 7 5 % 乙醇中浸泡3 min 后 ，置超净工作台内，无菌条件下，快速切取部分肝脏、脾 ，游离股骨。

(2) 肝脏、脾 组 织 在 180〜2 0 0 目不锈钢网上研磨过滤，经 4 号针头 ( 或 — 次 性 无 菌 lml注射器) 过滤，制备单细胞悬液。

(3) 股骨游离后，从两端关节处剪断，经注射器冲洗，同样针头过滤，制备骨髓单细胞悬液。

⑷ 在 骨 髓 、外周血、肝 脏 、脾脏各细胞悬液中加入红细胞裂解液以裂解红细胞，室温避光孵育 15 min。

(5) P B S 洗漆， 70 哗 尼 龙 网 过 滤 后 ，轻柔重悬。

(6) 每只管中分另 Ij 加 人 1 0 0 抗 C D 45/C D 3/C D 4 抗体；室温避光孵育 2 〇 min。

(7) P B S 洗 涤 ，重悬，终 体 积 300ul。

(8) 上机检测。

NOD/SC ID 小 鼠 骨 髓 中 人 CD4 5 + 细 胞 的 RT-P C R 检 测 (两 步 法 ) ：

1 ) 细 胞 R N A 抽提

(1) 冲洗小鼠股骨中的细胞，每 5xl06〜 IOxlO6 个细胞加入 ImI Trizol 试剂。

(2) 将 细 胞 并 Trizol 试 剂 一 起 移 入 1.5m l 离心管中，室温 静 置 5 min; 使核°蛋白体完全解离。

(3) 加入〇.2 ml 氯仿，颠倒混匀，剧 烈 振 荡 15s，室温静置 5min。

(4) 4 ℃ 、 10 000〜12 000 g离心 15min。

(5) 小 心 将 上 层 水 相 (约 60%) 移 至 1.5 ml E p 管中，再 加人 500 ul异丙醇，振荡混勻，室 温 20 min。

(6) 4 ℃ 、： 12 OOOg 离 心 IOmin ， 凝胶样沉淀物为 R N A 。

(7) 吸弃上清，并 用 Iml 7 5 % 乙醇洗涤 R N A 沉 淀 1 次。

(8) 4 ℃、 7500 g 离心 IOmin0

(9) 晾干沉淀，加 入 50^1 纯水溶解 R N A 沉 淀 ， -70℃ 冰箱冻存备用。

2 ) 逆转录反应

⑴ 细 胞 总 R N A 2 ug + Oligo dT 0.5ug，补水至终体积 10ul，90℃ 加 热 5 min，冰上骤冷。

(2) 反应体系：

结 果 判 断

利 用 NOD/SCID 小鼠联合免疫缺陷的特点，在经亚致死剂量照射摧毁体内造血能力 后 ，移植异体造血干细胞，可在外周血中检测到供体来源的血细胞；在小鼠各脏器内可见局灶性组织增生，多系造血细胞增殖，主要由红系、粒 系 、巨核细胞系组成。其检测可利用外源细胞的标记，如人白细胞 CD4 5 , 或雄性个体 Y 染 色 体 上 的 基 因等标记。

通过本实验可初步证明植入的造血干/祖 细 胞 在 NOD/SCID 小鼠体内的造血重建能力 ；进一步的实验可选择优化植入步骤，增加移植效率作为切入点，为临床应用提供理论支持。

注 意 事 项

(1) NOD/SOD 小鼠为联合免疫缺陷，抵抗力极弱，在伺养过程中要注意无菌操作，避免感染而导致的动物死亡；另外，受抗原刺激后的小鼠可能会增加其 N K 细胞的活性，降低移植效率。

(2) 照射剂量的把握是实验的关键，过量照射容易导致动物早期死亡率的增加，影响结果的观测。

(3) 植入细胞的数量也是需要重视的地方，植入细胞数目舍少会给后期的检测带来困难 ；而较多的细胞植入又可能会带来移植物抗宿主反应 (graft-versus-host disease，GVHD)

⑷ NOD/SCID 小鼠因体内免疫缺陷，体内自发成瘤较高，成活时间大多在 1 年左右 ，对于长期的体内植入实验有一定的限制。射 前 2 周 ，饮水加抗生素：新 霉 素 lg/L ，多黏菌素 B 106U/l，