材料

 

 

 

方法

标本和组织处理
大多数标本的条形码分析是直截了当的，但高度依赖于 D N A 的初始条件。因此,必须小心确保样本是在不损伤 D N A 的方式下处死的，收集后尽快进行分析（ 见注释1 ) , 且应采取预防措施来防止被其他种类 D N A 污 染（见注释 2)。有六个关键步骤来确保每一个标本的正确处理和编档。

1.将标本安排为 9 4 个 一 批（ 见注释 3)。 为 9 4 个标本中的每一份激光打印一个标有单独登记号的小标签。如果一个凭证标本需要保存，在其上或其容器上贴一个标有其登记号的标签。

2.用乙醇或清洁剂清洁工作表面，除去 DNA 和 DNA 酶污染。

3.对每个标本，用酸或火焰除菌的镊子和（ 或）手术刀取下一小块组织样本。将样本放人 TrakMates 盒里一个独立的保存管中，并贴好相应的标本登记标签。

4.室温保存时，将管中充满乙醇。对于干燥的组织（例如昆虫腿）或要冰冻保存的组织，可不必额外加乙醇。

5.在电子表格程序上记录标本登记号及相关数据（关于表格程序和归档，见w w w .barcodeoflife.org)。

6.给每个标本拍照。

基因组 DNA 提取/纯化

基因组 DNA 的提取和（ 或）纯化有很多可供选择的方法（见注释 4)。其中很多方法在高通量动物 DNA 条形码中的效率已经过了全面的检测（2 4 ) ; 两个针对新鲜/冰冻组织或存档组织的非常有效的操作方法在下面内容中分别加以说明

5.用多通道移液器在每孔的葡聚糖凝胶中央加人测序反应物（约 10 u L )。

6.用多通道移液器和一个 8 孔 P C R 管条，在 无 菌 的 9 6 孔反应板的每孔中加入

1 0 / xL 甲酰胺。

7.洗脱纯化的测序反应物到甲酰胺中，将反应板放到葡聚糖凝胶滤板下方，用橡胶带固定， 750 g 离 心 3m i n。

3.7 测序分析

D N A 条形码设备要求高通量测序。 Applied Biosystem 和 A m e r s h a m 公司拥有几种可靠的且具备不同测序能力的设备。以下方案采用的是 Applied Biosystem 3730 毛细管测序仪。

1.在反应板上盖上胶垫。

2.将反应板放人基座，装上定位器。

3.在装配好的板上，打印并粘贴一个条形码。

4.装配好的板放人 3730 仪器中。

5.需要时进行常规的 3730 检修。

6.使用数据收集系统的板管理器，输入板号。

7.在运行调度程序中开始运行。

3.8 测序编辑/比对

分析高通量条形码的序列编辑和比对软件包的基本功能包括收集双向数据和编辑跟踪文件。 Sequencher、 SeqScape 和 Lasergene 等软件都具有这样的功能，也具备其他功能。

1.使用选用的程序或软件，打开测序完成后的跟踪文件。如果选择的软件功能强大的话，所用样本可以一次分析完成。

2.收集每个样本的正向和反向读取的数据。

3.去除每组数据中的引物序列。

4.仔细校对每个碱基名称，对于错误命名或者未命名的碱基做适当的调整。

5.用 Fasta 格式保存序列，上传至合适的项目或者其他在线序列库。

注释

1. 不损伤 D N A 的处理方法指的是冷冻、氰化物处理或者乙醇浸泡，尽量避免用乙酸乙酯或者福尔马林这些可损伤 D N A 的方法处理。 D N A 在脱水的样本中通常可以保存至少一年，之后会慢慢发生降解。冷 冻 样 本（特别是保存在低温状态）的 D N A 会保持长时间的稳定。但是在乙醇保存的样本中的 D N A 会因为酸化作用常发生降解。因此，条形码分析最好在样本收集好之后立即进行。

2.所用样本应该在干净的表面操作，所用组织处理仪器在处理每个样本之后都要用酸或火焰灭菌。过程中留两个空白孔用于阳性对照和阴性对照，其 余 94 孔用于样品，小心避免加样时孔间的交叉污染。

3 . 在任何想要高产率的实验室，所有条形码的分析步骤须在 96 孔板中进行。操作

4. 除了这里讨论的基于 chelex 和膜的方法之外，还有许多其他可供选择的试剂盒用于 D N A 的分离和释放。磁珠的运用越来越普遍，主要因为其操作便于自动化。在时间紧急的情况下，有几种试剂盒可保证在几分钟之内完成 D N A 抽提，例如 Extract-N - A m p P C R Kit(Sigma-Aldrich) 和 F T A cards (Waterman-Florham Park， N J )。这些方法现正被评估用于高通量 D N A 条形码方法的可行性。

5.D r y R ekase 是基于 chelex 的分离 D N A 的方法，可迅速释放 D N A 于溶液中，以进行下游的应用操作 （24)。它只需要极少的组织样本并缩短操作时间，但不适于含有高水平 P C R 抑制剂的样本（如血红蛋白）和 D N A 已降解的样本，以及需长期保存的纯化 D N A 。

6.反应体积取决于样本的体积，可 从 30〜100 ^L 。例如，小型甲壳类动物或小型昆虫的腿等器官组织只需要 30 juL 抽提液。而脊椎动物的小块组织则可用 100〜110 u L 裂解提取液。

7.Nucleospin 96 Tissue 试剂盒是基于膜的 D N A 抽提方法，取决于高盐浓度下D N A 与二氧化硅膜的亲和力。这种方法非常敏感并可获得高纯度的 D N A ，可用于研究有降解的 D N A 样品。高昂的成本和需花费大量的时间限制了它的应用。

8.使用该方法和其他的大部分试剂盒一样，需用手动或电动的多道移液器来高效地进行 96 孔板上 D N A 的抽提操作。类似的，几乎所有的用于 96 孔板的试剂盒和操作步骤均可以用自动分液装置工作站进行。

9.在用 DryRelease 方法时，少 量 标 本（或 D N A 有可能降解的样本）用少量蒸馏水洗脱即可，而当用新鲜或大块样本时需用大量水洗脱。

10.离 心 ％ 孔板时需放在正方形离心模块上，或者放置于开放的 M N 试管离心架上以免离心力的作用使其碎裂。

11. 引物设计至关重要，微小的改变将会对条形码的合成产生极大的影响。研究一个新的种群所要做的第一步是鉴别出一个最优化的引物。为了解决引物和模板D N A 之间的错配，建议使用简并引物或含次黄嘌呤的引物 （26)。通过含有2〜4 个简并碱基或次黄嘌呤碱基引物的运用，可从复杂的模板中得到较好的条形码扩增，并且防止核内假基因的扩（27）。

12. 所有的 P C R 试剂的相关操作推荐使用灭菌的含塞子的吸头以避免不必要的污染 。在开始实验操作前用酒精或去垢剂清洁操作台面。在建立反应前， D N A模 板（D N A 抽提物或 P C R 产物）应远 离 P C R 试剂。所有试剂取用完毕并重新放回冰箱后，再加人 D N A 模板。

13.添加海藻糖是可选的，但加人海藻糖后可能会增加 P C R 反应成功的机会 （28)(图 4)，并可促进冻结分装好的主混合液。该混合液可把存于—20- C i〜3 个月

或直接分装于 96 孔板于一 20°C 保 存 1 个月。

14.为节约成本，反应体系可显著缩小。为了精确分装微量的试剂，准备足够多的

可用于几块板的主混合液是必要的。注意必须备有额外的反应液，用予弥补多