限制性酶切标记基因组扫描检测基因突变实验_实验⽅法

实验原理

实验步骤

##一、材料

###1.封闭：偶发的损伤修复（repair of adventitious damage, RAD)

（1）高分子质量基因组 D N A : 330 ug/mL 溶于 T E 缓冲液（10 m m 〇l/L Tris， I

###2 限制性酶切和同位素标记

###3 二维电泳

3.1 一向电泳（1st D)

制备凝胶和原位消化所需要的装置如图2所示。

3.2 原位限制性内切酶消化

3.3 二向电泳（2n d D )

###4 放射自显影

##二、方法

###1.偶发性损伤修复（「封闭」，「blocking」)

###2.限制性酶切消化和同位素标记

###3.双向电泳

在建立当前的一向电泳操作程序过程中经历了大量的试验摸索。过去放射效应研究基金会（Radiation Effects Research Foundation) 的生化遗传学计划（The BiochemicalGeneticsProgram) 曾广泛地使用了圆盘凝胶电泳系统进行蛋白质突变体的研究，现在这种技术被用于 D N A 上。经过多次试验，我已经在内径 2. 4 m m 的 Telflon 管中进行琼脂糖圆盘凝胶电泳并得到了最好的结果。我发现由于管内壁不平整，可使得在长时间的电泳过程中，琼脂糖凝胶的位置不会移动。凝胶由 I.5 c m 0. 6 % 的浓缩胶和 59 c m 0 •9 % 的分离胶组成。图 3 就是垂直圆盘凝胶装置。这种装置可以同时分析 10 个 D N A 样本。垂直圆盘凝胶装置可高精度地分离大分子 D N A片段。此系统大大地减小了电泳的空间，并降低了原位消化需使用的昂贵的限制内切酶的量（原来的系统每个反应需要使用 Hinf I

3.1 一向电泳