用蛋白质组学方法对海洋环境中过氧 化物酶体增殖污染物进行风险评估实验
实验原理
一、材料
1.动物
一 年 中 的 问 一 时 间 在 不 同 米 样 点 潮 落 时 采 集 贻 贝 Lmk，35〜45 mm 长）或者是贝壳长度为 5 cm 的 紫 贻 贝 edwfe)。其中一个采样点是有记录的清洁区域，在这里采集到的动物作为对照。
2. 富含过氧化物酶体组分的分离
在分离过程中所有缓冲液都需新鲜配制，并在冰浴中操作。
3. 蛋白质的沉淀
（1） 2 0 % (V/V) TCA (trichloroacetic acid) /冷丙酮， 0.07% (3-疏基乙醇。储存于—20°C 的冰箱。
（2） 1 0 0 % 丙酮。储存于一 20°C 的冰箱。
4. 促 溶 ，再水化
（1）促溶缓冲液： 7 mol/L 尿素， 2 mol/L 硫脈， 2 % CHAPS， 0 . 5 % TritonX-100,1% β-巯基乙醇， l % Pharmalyte， 1 % DTT。
（2）再水化缓冲液： 8 mol/L 尿 素 ， 2 % CHAPS, 15 mmol/L D T T ， 1 % p-巯基乙醇 ， 0 . 2 % Pharmalyte0
（3）0• 95 mol/L IAA (碘代乙酰胺， iodoacetamide)。
5. 等电聚焦和平衡
（1）平 衡 缓 冲 液（ EQ): 6 mol/L 尿素， 5 0 mmol/L T ris, 3 0 % 甘油， 2 % SDS，考马斯亮蓝， pH 8. 8。
（2） EQ 含 1 % 的 DTT。
（3）EQ 含 4 % 的 IAA。
6. SDS-PAGE
这些装置最好使用预制胶和标准类型的 12. 5 % Tris-HC1。如 果 SDS——PAGE 胶在实验室自己准备的话，推荐用 I c m 厚度的胶。
（1）0.5 % 琼脂糖在电泳缓冲液中溶解。
（2）电 泳 缓 冲 液（5 X ): 125 mmol/L Tris, 960 mmol/L 甘 氨 酸 ， 0 . 5 % SDS，pH 8. 3
7 .考马斯亮蓝染色
（1） 固定液：甲醇-乙酸-水（45 : 1 : 54)
（2）染色液： 1 7 % 硫酸铵， 3 4 % 甲醇， 3 % 磷酸， 0 . 1 % ( W/V ) 考马斯亮蓝 G250。
二、方法
通过这种方法可以获得由暴露于污染环境时表达发生改变的蛋白质构成的 PES。在野外实验中，选择一块未被污染的区域作为对照区域对得到可靠的结果是必要的。理想化的条件是从对照和实验区域中收集的动物应暴露于相同的生物（年龄 、贝壳大小等）和 非 生 物 条 件（盐度、 pH、温度等）中。
1. 富含过氧化物酶体组分的分离
组织匀浆和通过碘克沙醇密度梯度离心分离亚细胞组分按已建立的方法（2 1 ) 进行并稍有改进。主 要亚细胞组分的命名是根据 Volkl 和 Fahimi 使 用 的 术 语（22)。因此，总匀浆被命名为 A ，重的线粒体组分称为 B，轻的线粒体或富含过氧化物酶体的组分为D，胞质组分为 E ，微粒体组分为 F (图 1)。
（1）分 离 50 个贻贝的消化腺（约 5 g)。所有的采样区域的实验同时进行。
（2）按 3 mL/g (湿重）加人冰 HM 缓冲液，将组织在组织研磨器中研磨成小片状
（3）使用松紧合适的研磨棒低速三次研磨获得组织匀浆，将匀浆转人试管中。
（4）用低速冷冻离心机 70 g 离 心 IOmin 以去除残渣、未破碎的细胞和大部分细胞核。
（5）移走上清液，在沉淀中加入 2 m L /g 的 冰 HM 缓冲液，再次勻浆和离心。
（6）将第一次和第二次的上清液混合，作为组分 A 。
（7）在高速冷冻离心机中 1950 g 离心组分 A IOmiiu
（8）离心后缓慢倒出上清液再次在 l 950 g 下离 心 8 min。最后的沉淀包括线粒体组分B 的主要部分，上清液为组分 C。
（9）把 上 清 液 成 分（组 分 C 在 39 O O O g 下 离 心 45 min，移 走 包 括 细 胞 质（组 分 E)和 微 粒 体（组 分 F) 的上清液；然后用玻璃棒将沉淀溶于 2 m L 的 冰 HM 缓冲液中。沉淀中包括了富含过氧化物酶体和轻线粒体的组分，即 D。
（10）将 I m L 组 分 D 小心地置于梯度液之上。梯度液包括 6 mL 2 8 % 碘 克 沙 醇（V/V )、 5 mmol/LMOPS、 0 . 1 % 乙醇、 lmmol/L EDTANa4 溶 液（pH7. 3 , 密度1.16 g/mL) 和 I mL 5 0 % 碘 克 沙 醇（V A O 、 5 mmol/L MOPS、 0.1 % 乙醇、I mmol/L EDTANa4 溶 液（密度 I.27 g/mL)。然后在 Beckman L7-55 离心机中使用 TFT50. 2T i 转 子 在 40 OOOr/min (131 000 g )下 离 心 2 h。富含过氧化物酶体的组分将在 2 8 % 和 5 0 % 碘克沙醇溶液之间获得。
（11）可采用生化方法评估获得的富含过氧化物酶体组分。要尽量保证从不同采样点提取的过氧化物酶体组分有相同的质量。否则，在任何样本中掺杂的其他蛋白质污染将会干扰下一步的分析。在分离过程中可测量下列标记酶的活性：过氧化物酶体中的过氧化氢酶（catalase, CAT)、线 粒 体 的 號 拍 酸 脱 氢 酶（succinate dehydrogenase, SD) 和溶酶体的酸性憐酸酶（acidic phosphatase, AP) (23)。 蛋白质
浓度通过 Bradford 法 或 其 他 相 关 方 法 测 定（24)。另外 ，可应用不同的商业化多克隆抗体，使用经典的化学发光法来进行蛋白质凝胶印迹分析（图 2)。
2. 蛋白质沉淀
（1） 为了沉淀样本，需 将 I X 体积的 2 0% TCA (冷丙酮中，含 0.07% |3-巯基乙醇)与 I X 体积的样本混合。 T C A 溶液必须新鲜配制。最后 T C A 浓度为 1 0 % 。
（2）在一 20°C 中至少沉淀 45 min。每 15 min 搅 拌 一 次（见注释 3)。
（3）在冷冻离心机中以 12 000 g 离 心 10 min。
（4）去除上清液，然后以 12 OOOg 离心甩去剩余的 TCA, 否则它将影响 pH。
（5）用 I mL 冷 丙 酮（含 0. 0 7 % |3-巯基乙醇）清洗沉淀并混匀。然 后 以 12 000 g 在低温下离心 lOmin。如果获得的上清液还是黄色的话，重复这一步骤。
（6)去除上清液，以 12 OOOg 离心甩除丙酮。这样可以减少干燥时间。
（7）在室温下打开试管盖干燥 20〜30 min。可以用锡箔纸或类似的东西覆盖管口以免灰尘或别的东西污染。
3. 溶解和再水化
（1） 在沉淀样本中加入促溶缓冲液。加入等于等电聚焦上样量一半体积的促溶液。根据不同长度的 IPG 胶条，以下为推荐的上样量： 7 cm 胶条， 125 uL ; 1lcm胶条 ， 1 8 5 uL ； 18 cm 胶条， 2 5 0 uL。同 时 加 人 1uL 0 . 0 1 % ( W /V ) CBB ，在室温下振荡 15 min。
（2）加入 O.95mol/L IA A ，使其终浓度为 30 mmol/L。在室温下振荡 15 min。此溶液需要新鲜配制。
（3）加人再水化缓冲液（即余下的一半体积），在室温下振荡 30 min。
（4）室温下以 5000 g 离 心 lOmin。
（5）测定蛋白质浓度。通过任何方法如 Bradford 法（2 4 ) 或 Smith 法 （2 5 ) 来测定蛋白质浓度，推荐仅使用 1〜2 uL 样品。
（6）如果样品无法马上使用，建议将其保存于 4°C 冰箱。
4 .等电聚焦与平衡
以下以使用 Bio-Rad 的 Portean IEF cell 为例。
（1）将上清液倒入聚焦盘中，将 IPG 胶条置于其上，注意胶条下不能有气泡。
（2）等电聚焦方法：
对 于 11 cm 的 IPG 胶条：被动再水化 12〜15 h，快速升压。
第一步： 250V 15 min。
第二步： 8000V 2. 5 h。
第三步： 8000V 直到达到 35 000 V • h (如必须，可达到 45 OOOV • h)。
再水化后加人矿物油覆盖胶条。
（3） 在等电聚焦后， IPG 胶条可以马上平衡或储存于一 20°C 冰箱中。
（4）室温下将 IPG 胶条置于含有 1 % D T T 的平衡液中在摇床上平衡 15 min。
（5）室温下将 IPG 胶条置于新的含有 4 % I A A 的平衡液中在摇床上平衡 15 min。IA A 需新鲜制备。
5 .SDS——PAGE 电泳
以下操作以使用 Bio-Rad 的 Criterion SDS^PAGE cell 或 Dodeca cell 和 Criterion gel为 例（见 注 释 4、注 释 5)。
(1)将 IPG 胶条置于 SDS——PAGE 胶上，确保两者之间没有气泡。
(2)加 人 0 . 5 % 的 琼 脂 糖（溶于电泳缓冲液中）于胶条上，封住胶条。
(3)这一过程需在冷室中进行，用磁性搅拌棒保证电泳缓冲液维持在同一温度。电泳缓冲液温度应与室温相同或更低。
(4) Ilcm 的胶在 120V 下直到 CBB 到达胶的底部。而 对 于 18 cm 的胶而言，需采用恒定的电流。在 前 30 min 采 用 16 mA，然后调电流至 24 mA 直 到 CBB 到达底部。
6 .考马斯亮蓝染色
（1）在固定液中固定 30 min。
（2）在考马斯亮蓝中染色 12〜18 min。
（3）在甲醇中脱色 2〜3 min。
（4）在水中脱色 12 h 或直到背景清晰。多换几次水更好，这样背景更干净。然后将胶保存于冷室中直到扫描分析或用质谱鉴定蛋白质（图 3 、 图 4)。
7 .图像获取和分析
（1） 可用 Amersham Biosciences 公司的 Image Scanner 扫描。
（2）数据通过 Amersham Bioscience 公司的 Image Master Platinum 6. 0 或市场上其他合适的软件进行分析。
（3）图像分析包括点的检测、点的量化、标准化、背景去除和点的匹配，然后再进行统计学分析。
（4）每个蛋白质点的量通过点的体积来表达，定义为所有构成该点的像素密度的总和。
（5）为了校正 CBB 染色的差异，并反映出点之间量上的差异，点的体积进一步表示为该点占胶上所有点的体积的百分比。不同样本间的所有点都通过这一百分比值进行显著性分析。污染区样本的 2-DE 图谱可以与对照组进行对比。为了发现那些表达明显改变（上调或下调） 的点，对两个样本进行 i 检验，只有显著性为 9 5 % 或更高的蛋白质点才予以考虑。
实验步骤
一、材料
1.动物
一 年 中 的 问 一 时 间 在 不 同 米 样 点 潮 落 时 采 集 贻 贝 Lmk，35〜45 mm 长）或者是贝壳长度为 5 cm 的 紫 贻 贝 edwfe)。其中一个采样点是有记录的清洁区域，在这里采集到的动物作为对照。
2. 富含过氧化物酶体组分的分离
在分离过程中所有缓冲液都需新鲜配制，并在冰浴中操作。
3. 蛋白质的沉淀
（1） 2 0 % (V/V) TCA (trichloroacetic acid) /冷丙酮， 0.07% (3-疏基乙醇。储存于—20°C 的冰箱。
（2） 1 0 0 % 丙酮。储存于一 20°C 的冰箱。
4. 促 溶 ，再水化
（1）促溶缓冲液： 7 mol/L 尿素， 2 mol/L 硫脈， 2 % CHAPS， 0 . 5 % TritonX-100,1% β-巯基乙醇， l % Pharmalyte， 1 % DTT。
（2）再水化缓冲液： 8 mol/L 尿 素 ， 2 % CHAPS, 15 mmol/L D T T ， 1 % p-巯基乙醇 ， 0 . 2 % Pharmalyte0
（3）0• 95 mol/L IAA (碘代乙酰胺， iodoacetamide)。
5. 等电聚焦和平衡
（1）平 衡 缓 冲 液（ EQ): 6 mol/L 尿素， 5 0 mmol/L T ris, 3 0 % 甘油， 2 % SDS，考马斯亮蓝， pH 8. 8。
（2） EQ 含 1 % 的 DTT。
（3）EQ 含 4 % 的 IAA。
6. SDS-PAGE
这些装置最好使用预制胶和标准类型的 12. 5 % Tris-HC1。如 果 SDS——PAGE 胶在实验室自己准备的话，推荐用 I c m 厚度的胶。
（1）0.5 % 琼脂糖在电泳缓冲液中溶解。
（2）电 泳 缓 冲 液（5 X ): 125 mmol/L Tris, 960 mmol/L 甘 氨 酸 ， 0 . 5 % SDS，pH 8. 3
7 .考马斯亮蓝染色
（1） 固定液：甲醇-乙酸-水（45 : 1 : 54)
（2）染色液： 1 7 % 硫酸铵， 3 4 % 甲醇， 3 % 磷酸， 0 . 1 % ( W/V ) 考马斯亮蓝 G250。
二、方法
通过这种方法可以获得由暴露于污染环境时表达发生改变的蛋白质构成的 PES。在野外实验中，选择一块未被污染的区域作为对照区域对得到可靠的结果是必要的。理想化的条件是从对照和实验区域中收集的动物应暴露于相同的生物（年龄 、贝壳大小等）和 非 生 物 条 件（盐度、 pH、温度等）中。
1. 富含过氧化物酶体组分的分离
组织匀浆和通过碘克沙醇密度梯度离心分离亚细胞组分按已建立的方法（2 1 ) 进行并稍有改进。主 要亚细胞组分的命名是根据 Volkl 和 Fahimi 使 用 的 术 语（22)。因此，总匀浆被命名为 A ，重的线粒体组分称为 B，轻的线粒体或富含过氧化物酶体的组分为D，胞质组分为 E ，微粒体组分为 F (图 1)。
（1）分 离 50 个贻贝的消化腺（约 5 g)。所有的采样区域的实验同时进行。
（2）按 3 mL/g (湿重）加人冰 HM 缓冲液，将组织在组织研磨器中研磨成小片状
（3）使用松紧合适的研磨棒低速三次研磨获得组织匀浆，将匀浆转人试管中。
（4）用低速冷冻离心机 70 g 离 心 IOmin 以去除残渣、未破碎的细胞和大部分细胞核。
（5）移走上清液，在沉淀中加入 2 m L /g 的 冰 HM 缓冲液，再次勻浆和离心。
（6）将第一次和第二次的上清液混合，作为组分 A 。
（7）在高速冷冻离心机中 1950 g 离心组分 A IOmiiu
（8）离心后缓慢倒出上清液再次在 l 950 g 下离 心 8 min。最后的沉淀包括线粒体组分B 的主要部分，上清液为组分 C。
（9）把 上 清 液 成 分（组 分 C 在 39 O O O g 下 离 心 45 min，移 走 包 括 细 胞 质（组 分 E)和 微 粒 体（组 分 F) 的上清液；然后用玻璃棒将沉淀溶于 2 m L 的 冰 HM 缓冲液中。沉淀中包括了富含过氧化物酶体和轻线粒体的组分，即 D。
（10）将 I m L 组 分 D 小心地置于梯度液之上。梯度液包括 6 mL 2 8 % 碘 克 沙 醇（V/V )、 5 mmol/LMOPS、 0 . 1 % 乙醇、 lmmol/L EDTANa4 溶 液（pH7. 3 , 密度1.16 g/mL) 和 I mL 5 0 % 碘 克 沙 醇（V A O 、 5 mmol/L MOPS、 0.1 % 乙醇、I mmol/L EDTANa4 溶 液（密度 I.27 g/mL)。然后在 Beckman L7-55 离心机中使用 TFT50. 2T i 转 子 在 40 OOOr/min (131 000 g )下 离 心 2 h。富含过氧化物酶体的组分将在 2 8 % 和 5 0 % 碘克沙醇溶液之间获得。
（11）可采用生化方法评估获得的富含过氧化物酶体组分。要尽量保证从不同采样点提取的过氧化物酶体组分有相同的质量。否则，在任何样本中掺杂的其他蛋白质污染将会干扰下一步的分析。在分离过程中可测量下列标记酶的活性：过氧化物酶体中的过氧化氢酶（catalase, CAT)、线 粒 体 的 號 拍 酸 脱 氢 酶（succinate dehydrogenase, SD) 和溶酶体的酸性憐酸酶（acidic phosphatase, AP) (23)。 蛋白质
浓度通过 Bradford 法 或 其 他 相 关 方 法 测 定（24)。另外 ，可应用不同的商业化多克隆抗体，使用经典的化学发光法来进行蛋白质凝胶印迹分析（图 2)。
2. 蛋白质沉淀
（1） 为了沉淀样本，需 将 I X 体积的 2 0% TCA (冷丙酮中，含 0.07% |3-巯基乙醇)与 I X 体积的样本混合。 T C A 溶液必须新鲜配制。最后 T C A 浓度为 1 0 % 。
（2）在一 20°C 中至少沉淀 45 min。每 15 min 搅 拌 一 次（见注释 3)。
（3）在冷冻离心机中以 12 000 g 离 心 10 min。
（4）去除上清液，然后以 12 OOOg 离心甩去剩余的 TCA, 否则它将影响 pH。
（5）用 I mL 冷 丙 酮（含 0. 0 7 % |3-巯基乙醇）清洗沉淀并混匀。然 后 以 12 000 g 在低温下离心 lOmin。如果获得的上清液还是黄色的话，重复这一步骤。
（6)去除上清液，以 12 OOOg 离心甩除丙酮。这样可以减少干燥时间。
（7）在室温下打开试管盖干燥 20〜30 min。可以用锡箔纸或类似的东西覆盖管口以免灰尘或别的东西污染。
3. 溶解和再水化
（1） 在沉淀样本中加入促溶缓冲液。加入等于等电聚焦上样量一半体积的促溶液。根据不同长度的 IPG 胶条，以下为推荐的上样量： 7 cm 胶条， 125 uL ; 1lcm胶条 ， 1 8 5 uL ； 18 cm 胶条， 2 5 0 uL。同 时 加 人 1uL 0 . 0 1 % ( W /V ) CBB ，在室温下振荡 15 min。
（2）加入 O.95mol/L IA A ，使其终浓度为 30 mmol/L。在室温下振荡 15 min。此溶液需要新鲜配制。
（3）加人再水化缓冲液（即余下的一半体积），在室温下振荡 30 min。
（4）室温下以 5000 g 离 心 lOmin。
（5）测定蛋白质浓度。通过任何方法如 Bradford 法（2 4 ) 或 Smith 法 （2 5 ) 来测定蛋白质浓度，推荐仅使用 1〜2 uL 样品。
（6）如果样品无法马上使用，建议将其保存于 4°C 冰箱。
4 .等电聚焦与平衡
以下以使用 Bio-Rad 的 Portean IEF cell 为例。
（1）将上清液倒入聚焦盘中，将 IPG 胶条置于其上，注意胶条下不能有气泡。
（2）等电聚焦方法：
对 于 11 cm 的 IPG 胶条：被动再水化 12〜15 h，快速升压。
第一步： 250V 15 min。
第二步： 8000V 2. 5 h。
第三步： 8000V 直到达到 35 000 V • h (如必须，可达到 45 OOOV • h)。
再水化后加人矿物油覆盖胶条。
（3） 在等电聚焦后， IPG 胶条可以马上平衡或储存于一 20°C 冰箱中。
（4）室温下将 IPG 胶条置于含有 1 % D T T 的平衡液中在摇床上平衡 15 min。
（5）室温下将 IPG 胶条置于新的含有 4 % I A A 的平衡液中在摇床上平衡 15 min。IA A 需新鲜制备。
5 .SDS——PAGE 电泳
以下操作以使用 Bio-Rad 的 Criterion SDS^PAGE cell 或 Dodeca cell 和 Criterion gel为 例（见 注 释 4、注 释 5)。
(1)将 IPG 胶条置于 SDS——PAGE 胶上，确保两者之间没有气泡。
(2)加 人 0 . 5 % 的 琼 脂 糖（溶于电泳缓冲液中）于胶条上，封住胶条。
(3)这一过程需在冷室中进行，用磁性搅拌棒保证电泳缓冲液维持在同一温度。电泳缓冲液温度应与室温相同或更低。
(4) Ilcm 的胶在 120V 下直到 CBB 到达胶的底部。而 对 于 18 cm 的胶而言，需采用恒定的电流。在 前 30 min 采 用 16 mA，然后调电流至 24 mA 直 到 CBB 到达底部。
6 .考马斯亮蓝染色
（1）在固定液中固定 30 min。
（2）在考马斯亮蓝中染色 12〜18 min。
（3）在甲醇中脱色 2〜3 min。
（4）在水中脱色 12 h 或直到背景清晰。多换几次水更好，这样背景更干净。然后将胶保存于冷室中直到扫描分析或用质谱鉴定蛋白质（图 3 、 图 4)。
7 .图像获取和分析
（1） 可用 Amersham Biosciences 公司的 Image Scanner 扫描。
（2）数据通过 Amersham Bioscience 公司的 Image Master Platinum 6. 0 或市场上其他合适的软件进行分析。
（3）图像分析包括点的检测、点的量化、标准化、背景去除和点的匹配，然后再进行统计学分析。
（4）每个蛋白质点的量通过点的体积来表达，定义为所有构成该点的像素密度的总和。
（5）为了校正 CBB 染色的差异，并反映出点之间量上的差异，点的体积进一步表示为该点占胶上所有点的体积的百分比。不同样本间的所有点都通过这一百分比值进行显著性分析。污染区样本的 2-DE 图谱可以与对照组进行对比。为了发现那些表达明显改变（上调或下调） 的点，对两个样本进行 i 检验，只有显著性为 9 5 % 或更高的蛋白质点才予以考虑。
注意事项
（1） 亮肽素、抑肽酶、 e-氨基己酸和 D T T 储液溶解在水中。 PMSF 是一种危险物，用异丙酮制备 100 mmol/L 的储液。
（2）为了配制促溶和水化缓冲液，建议先在室温下用少量 MilliQ 水溶解尿素，然后再加硫脲。尿素-硫 脲 溶 液 通 过 10 mg/mL 离子交换树脂清洗。振荡后静置IOmin， 用吸头移走上清液。
（3）在 TCA 沉淀蛋白质时，蛋白质浓度不同产率亦不同。蛋白质浓度大约在 1 mg/mL 得到的结果最好。
（4) 在进行 SDS-PAGE 电泳时，要确保 IPG 胶条与胶面之间没有气泡。另一种方法是先将琼脂灌在 SDS^PAGE 上 ，再慢慢把 IPG 胶条放上。
（5）在进行 SDS-PAGE 电泳时，如果电泳缓冲液很冷，进程会减慢很多；如果电泳缓冲液太热了，胶会电泳得不连续。
