位点特异性核酸内切酶的蛋白质工程
实验原理
实验材料
实验步骤
此处列出的方法概括了为定点突变而做的氨基酸位点选择（见 3.1)、为在细菌细胞中表达而做的 MutH 蛋白突变 （ 见 3.2 ) 和 MutH 变体的鉴定（见 3.3 )。
3.1 为定点突变对氨基酸的选择
从生物技术信息国家中心基因组基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST) 页面（ http : //www. ncbi. nlriLnih. gov /BLAST/) [ 24 ] 得到 MutH 蛋白和相关限制性内切核酸酶的序列。更多的序列从 PSI BLAST 服务器 [ 25 ] 得到。使用 PAM250 矩阵，用 ClustalX 程序比对序列。比对好的序列用 GeneDoc 程序分析 [27] 。程序的使用方法可在程序内使用 “Help” 功能得到。结构的坐标从 PDB 数据库（http : //www. rcsb . org/pdb/ ) 得到。程序 RasWin 和 Swiss PDB viewer 用于结构观察。
3.1.1 与 DNA 结合有关的保守残基团的辨别
在序列比对（如用 ClustalW 或 ClustalX) 之后，完成下列步骤。
( 1 ) 将比对结果输入 GeneDoc 程序（见 2.1；参考文献 [27])。
( 2 ) 用 “Group” 功能将序列分组（如一个组包含 MutH，而另一个组包含限制性 ( 切核酸酶)。
( 3 ) 鉴别组特异的残基（见注 1)。
( 4 ) 用 GeneDoc内的 “RasMol Script Dialog” 功能，生成 RasMol 执行文稿，以将组特异残基映射入（标记在）MutH 蛋白结构中。
( 5 ) 将 MutH 结构载入 RasMol 程序（见 2.1；参考文献 [ 28 ] ) ，在 “RasMol Command Line” 用 “Script” 命令执行从 GeneDoc 输出的文稿，以观察组特异残基。
( 6 ) 辨别位于假设为 DNA 结合位点的候选残基。
3.1.2 辨别接触特定碱基的残基
( 1 ) 下载限制性内切核酸酶与 DNA 底物（或产物）形成复合物的现有序列。
( 2 ) 运行 Swiss PDB viewer，以 3 个催化残基（如 MutH 的 D70、E77 和 K79 ) 的主链原子为种子，将限制性内切核酸酶结构与目标 MutH 结构进行匹配。
( 3 ) 用 “Improve fit ” 功能增强拟合效果。
( 4 ) 将重叠结构的坐标输出到电子制表程序。
( 5 ) 计算目标蛋白（如 MutH ) 的任意原子到重叠结构中碱基的距离，此碱基对应于目标蛋白中的目标碱基。
( 6 ) 对所有重叠结构，重复这些步骤。
( 7 ) 计算平均距离，并辨认对感兴趣碱基距离最近的残基。
( 8 ) 将结果与组特异残基分析比较。
( 9 ) 为定点突变选择有希望的残基。
3.2 MutH 变体定点突变
MutH 变体的克隆，采用如 Kirsch 和 Joly 所述 [29] 修改过的 QuikChange 操作规程 (Stratagen)，用质粒 pMQ402 ( 来自 Dr. M.G.，University of Massachusetts Medical School，MA ) 为模板，以及两个寡聚脱氧核苷酸用于突变以适合于产生长度在 50~500 bp 的 PCR 产物（见注 2)。
3.3 MutH 变体的纯化和鉴定
为了适合于体外测试，MutH 变体必须得到纯化。
3.3.1 从细菌细胞纯化 MutH 变体
( 1 ) 用细菌质粒以标准分子生物学方法转化 XL-1 Blue MRF 细胞。
( 2 ) 将细胞平铺在含有氨苄青霉素的 LB 培养板上，于 37°C 过夜培养。
( 3 ) 选一单菌落，在 500 ml 含 75 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 培养液中，于 37°C 生长。
( 4 ) 在 600 nm 处光密度值为 0.8 时，于 28°C，用 0.2% ( m/V ) 阿拉伯糖（终浓度）诱导 2.5 h ( 见注 3 )。
( 5 ) 以 3000 g 离心细胞 10 min。
( 6 ) 重悬细胞团于 10 ml 结合缓冲液中 [ 见 2.3 (9)]。
( 7 ) 用 Branson 超声机，输出级 5，占空率 50%，超声破碎悬浮物 5 次，每次 1 min。每次超声间歇冷却溶液 1 min。
( 8 ) 在冷冻离心机上，以 30000 g 离心细胞碎片 30 min。
( 9 ) 于 4°C，将上清液与 Ni-NTA 琼脂糖浆柔和地混合 30 min。
( 10 ) 将 Ni-NTA 琼脂糖移至一空柱中。
( 11 ) 用 20 ml 清洗缓冲液冲洗该柱 [ 见 2.3 (10)]。
( 12 ) 用 0.5 ml 洗脱缓冲液 [ 见 2.3 ( 11 ) ] 洗脱。没有必要切除 His 标记，因其不干扰内切酶活性（见注 4)。
( 13 ) 以在 280 nm 处的光密度值作为判断依据，收集合并得到的每份蛋白质。
( 14 ) 于 4°C，用 500 ml 透析缓冲液 [ 见 2.3 ( 12 ) ] 透析样品最少 2 h。换缓冲液 2 次。
( 15 ) 用 500 ml 透析缓冲液 G [ 见 2.3 ( 13 ) ] 透析样品。
( 16 ) 在透析缓冲液 [ 见 2.3 ( 12 ) ] 中以 1 :10 比例稀释样品，测量 280 nm 处的光吸收，以便用理论消光系数计算 MutH 的摩尔浓度 [30] 。
( 17 ) 于 -20°C 保存蛋白质。
3.3.2 MutH 的切割分析
用含有未甲基化、半甲基化或全甲基化的单个 d ( GATC ) 位点（图 7.3 ) 的 DNA 底物（用它处所描述的方法合成的寡核苷酸，或者 PCR 产物，参考文献 [ 19 ] 和 [ 20 ] ) 来开展 MutH 和 MutH 变体的切割分析。用不同的荧光染料、（分别用 FAM 和 TET) 标记底物上下两端的链，以便检测每条链上的切割。
( 1 ) 10 nmol/L 浓度的 DNA 底物在 10 μl 含有 500 nmol/L 的 MutL 和浓度在 10~500 nmol/L 的 MutH 的测试缓冲液（见注 1；误，似应为 2.4 节，第 1 条 —— 译者） 中保温（见注 5)。
( 2 ) 反应混合物于 37°C 温育。
( 3 ) 以适当的时间间隔（10 s 到 30 min) 分装反应混合物，每份含 25 fmol PCR 产物，与 12 μl 模板抑制剂（Perkin- Elmer) 和 0.5 μl Gene-Scan -500 TAMRA size standard (Perkin- Elmer) 充分混合。
( 4 ) 加热到 95°C 2 min，并立即在冰上冷却。
( 5 ) 在配有 47 cm ( 内径 50 μm) 毛细管（其中含有加了 8 mol/L 尿素的 POP-4 聚合物（Perkin- Elmer) ) 的 ABI PRISM 310 基因分析仪（Perkin- Elmer) 上分析样品。
( 6 ) 用 5 s，将样品电注入毛细管，使用电压 15000 V，并在 15000 V 和 60°C、使用 1X 基因分析缓冲液外加 1 mmol/L EDTA (Oerkin- Elmer) 作为电极缓冲液，使用 30 min 完成跑电泳过程。
( 7 ) 记录切割的和未切割的荧光标记的 DNA 数量（图 7.3 )。
( 8 ) 测定切割速度。
