独体—基于纤连蛋白类型Ⅲ结构域框架的抗体模拟 Akiko Koide and Shohei Koide

实验步骤

3.1 实物库构建

我们用 Kunkel 突变技术构建大多数的实物库虽然我们证明了  AB 链套可用来结合目标分子，但多数情况下，我们用 FNfn10 的 “上” 端（BC、DE 和 FG 链套；图 6.1A ) 作为目标分子结合位点 [ 10 ]。我们的方法基于 Bio-Rad 的 Mutagene kit [17]。用大肠杆菌 SS320 做电转化，可以很容易地制备含有大约 10⁹ 个独立克隆的实物库。



3.1.1 尿嘧啶单链噬粒的制备（用于单价噬菌体展示和酵母双杂交筛选)

( 1 ) 用 pAS47、pAS38 ( 用于独体-基因 III ) 或 pYT 45 (用于 B42-独体）转化 CJ236，在 LB- AP 平板中选择菌落。

( 2 ) 把一菌落接种到 2 ml 2X YT-Ap-氯霉素培养基，37°C 摇动过夜。

( 3 ) 将 30 ml 补充了 0.25 μg/ml 尿苷的预热 2X YT-Ap 培养基装入 250 ml 规格带凹陷三角烧瓶，用 300 μl  CJ236 过夜培养液接种，再加入 10¹⁰ 个/ml 辅助噬菌体 KO7( Promega)。在强力摇动下于 37°C 生长 2h。加入 Km 使终浓度达到 70 μg/ml。在强力摇动下于 37°C 生长过夜。

( 4 ) 于 4°C 以 12000 g 离心 [ 10000 r/min，用 SS-34 (Sorvall) 或等效的转子 ] 10 min。将上清液移入新试管，再次以 12000 g 离心 10 min。将上清液移入新试管。加入 4.5 ml PEG/NaCl 溶液，并彻底混合。4°C 保育过夜。

( 5 ) 于 4°C 以 17200 g 离心（12000 r/min，SS-34 转子）20 min。抛弃上清液将试管倒放在一叠纸巾上 1 min 。用纸巾擦去残余液体。

( 6 ) 将噬粒沉淀悬浮于 1 ml TBS 中，并移入微离心管。在微型离心机上以最大速度离心 2 min。将上清液移入新微离心管。加入 150 μl PEG/NaCl 溶液，彻底混合。在冰上保育 30 min。

( 7 ) 在 4°C 以最大速度离心 10 min。拋弃上清液，稍加离心，并用移液器除去所有液体。将沉淀悬浮于 1 ml TBS 中。

( 8 ) 用 XL-1 Blue 和 CJ236 测定噬粒浓度。将 100 μl 新鲜大肠杆菌（600 nm 光密度 OD 值为 0.5~1.0 ) 和 10 μl 系列稀释噬粒溶液混合。室温保育 15 min，并铺在 LB-Ap 板上。在 37°C 保育过夜。用 CJ236 的滴定值应该是 10¹²~10¹⁴ 个/ml，并且应该比用 XL-1 Blue 的值大 10⁴。

( 9 ) 用 Qiagen 单链 DNA 制备试剂盒制备尿嘧啶单链 DNA。

3.1.2 尿嘧啶单链噬菌体的制备（用于多价噬菌体展示载体， JCFN )

( 1 ) 用 JCFN 质粒转染 CJ236。热激之后，与 30 ml 预热的 2 X YT 和 500 μl 新鲜的 CJ236 ( OD₆₀₀ 值  0.5~1.0 ) 混合，再于 37°C 摇动 6 h。

( 2 ) 完成 3.1.1 节的步骤（4 ) 至（9 )。为测定浓度，混合 3 ml  LB 和 0.7% 琼脂糖（熔化后冷却至 45°C )，10 μl 连续稀释的噬粒溶液和 100 μl 新鲜的大肠杆菌。混匀并立即冲入 LB 平板中。在 37°C 培养保育过夜并测定滴度。

3.1.3 突变寡核苷酸的制备

( 1 ) 设计一寡核苷酸，取决于 GC 含量，使其分别含有大约 20 和 15 个碱基的 5' 或 3' 补区。我们使用密码 NNK 和 NNS 来进行 “硬”随机化，其中 N 代表所有核苷酸的等摩尔混合；K 代表 G 和 T 的等摩尔混合；S 代表 G 和 C 的等摩尔混合。

( 2 ) 将约 10 μg 溶解于水的粗寡核苷酸做丙烯酰胺凝胶电泳，切出对应于正确分子质量的带，将寡核苷酸用电洗脱（ 见注 3 )。

( 3 ) 将 2 μg 纯化的寡核苷酸、3 μl T4 多聚核苷酸激酶缓冲液、5U T4 多聚核苷酸激酶（New  England  Biolabs)、1.5 μl 10 mmol/L 腺苷三磷酸混合，加水至 30 μl。37°C 保育 2 h，然后 65°C 保育 15 min。将溶液在一20°C 保存。

3.1.4 双链 DNA 合成

( 1 ) 混合大约 1 μg 尿嘧啶单链 DNA、2 μl 磷酸化的寡核苷酸（见 3.1.3)，1 μl 10 X 退火缓冲液（Bio-Rad  Metagene  kit ) ，加水使体积达 10 μl  ( 见注4)。制备一无寡核苷酸的对照反应。

( 2 ) 使用聚合酶链反应（PCR) 仪，在 70°C 保温 5 min，然后以每分钟降 1°C 的速度，降温至 30°C。将试管置于冰上。

( 3 ) 在退火混合物中，加入 1 μl 10 X 合成缓冲液（ Bio-Rad  Metagene  kit ) 、1 μl T4 DNA 连接酶和 1 μl T4 DNA 聚合酶（New  England  Biolabs)。在冰上和室温相继保温各 5 min，37°C 保温 30 min，75°C 保温 15 min，然后冷却至室温。将 1 μl 样品通过琼脂糖胶 ( 电泳）。含有寡核苷酸的样品会得到比无核苷酸的对照样品所得分子质量高的产物。

( 4 ) 把一滴混合物放在飘在水上的 0.025 μm 透析膜碟上，透析合成混合物 1 h，然后在新的微离心管中复原透析过的混合物。使用前保存在冰上。

3.1.5 电穿孔胜任细胞的制备

( 1 ) 在 350 ml 含 Tc 的超级肉汤中培养大肠杆菌 SS-320 直至 OD₆₀₀ 达到 0.8。

( 2 ) 在冰浴中快速冷却三角瓶中的培养液，然后放置在冰上 15 min。将培养液移至离心瓶，在 0~2°C 以 3900  g [ 4700 r/min，用 JA -10 (Beckman) 或等效转子 ] 离心 5 min  ( 见注 5)。

( 3 ) 撇去上清液，通过在冰上敲击离心管，将细胞悬浮于 10 ml HEPES 缓冲液中。 加入 390 ml HEPES 缓冲液，并搅动使细胞悬浮。在 0~2°C 以 3900 g 离心 5 min。

( 4 ) 撇去上清液。将细胞悬浮于 10 ml HEPES 缓冲液中并将悬浮物移至 50 ml 离心管。用缓冲液漂洗第一个瓶子并在 50 ml 离心管中恢复细胞悬浮。

( 5 ) 在 0~2°C 以 4300 g ( 6000 r/min，用 SS-34 转子）离心 10 min。去上清液。在冰上敲击离心管使细胞悬浮于 10 ml 10% 甘油中，然后加入 20 ml 10% 甘油，并将离心管颠倒数次以使悬浮物混合。

( 6 ) 在 0~2°C 以 4300 g 离心 10 min。去上清液。加 300 μl 10% 甘油，并在冰上敲击离心管使细胞悬浮。检查体积，加 10% 甘油使终体积达 700 μl。将悬浮物等分至两个离心管中（各 350 μl)。

3.1.6 噬粒 DNA 电穿孔转染

( 1 ) 将冷却的 DNA [ 见 3.1.4，第（ 4 ) 步 ] 加入放在微离心管中的 350 μl 电转化感受态细胞中，并在冰上保温 5 min。将混合物移至预冷的电穿孔试管中（2 mm 间隙)。

( 2 ) 电穿孔细胞，如在 2.5 kV 高压模式下使用 BTX  ECM395 电穿孔器。

( 3 ) 立即在试管中加入 1 ml SOC，并使细胞悬浮。转移细胞至 250 ml 三角瓶。加 1 ml SOC 到试管中，清洗残留细胞并移入三角瓶中。再重复此操作 3 次。

( 4 ) 三角瓶中加入 20 ml SOC。在 37°C 以 180 r/min 摇动三角瓶 30 min。并通过放置部分稀释的悬浮物至 LB- Ap 平板检查浓度。

( 5 ) 将全部悬浮物加至 500 ml 预热的 2 X YT-Ap 中。为酵母双杂交的质粒制备，在 37°C 摇动过夜并制备质粒。为噬粒制备，加入 10¹⁰ pfu/ml 辅助噬菌体 KO7，在 37°C 摇动过夜，并如 3.1.1 节所述制备噬粒。

为噬菌体 DNA 的转化，在第 （3 ) 步之后，加入 1.5 ml 中对数期 SS -320 细胞，然后将悬浮物移至预热的 120 ml 2 X  YT-Tc。按照 3.1.2 节所述测定噬菌体浓度。37°C 保育 4 h。按照 3.1.1 节所述制备噬菌体。

3.1.7 酵母实物库构建

为酵母双杂交筛选，在大肠杆菌中，我们按照 3.1 节的描述构建了载体库，然后将这个库引入酵母中。酵母转化系基于 Gietz 的方法 [18] 。用这个方法，我们在典型情况下得到约 10⁶ 个独立克隆。

( 1 ) 在 30°C，20 ml YPD 中摇动过夜生长酵母 EGY48。将培养液加入预热的 300 ml YPD 使 OD₆₀₀ 值为 0.25。让细胞生长直至 OD₆₀₀ 值接近 1。

( 2 ) 在室温下以 3600 g ( 4500 r/min，JA-10 转子）离心 5 min 。撇去上清液，并悬浮细胞于 300 ml 灭菌水中。重复离心和悬浮。再离心，悬浮细胞于 25 ml 灭菌水，并移至 50 ml 离心管中。室温以 3000 g  ( 5000 r/min，SS34 转子）5 min。撇去上清液，并悬浮细胞于 1.2 ml 灭菌水。

( 3 ) 将 35 μl 细胞悬浮物放在一边用作负对照。在余下的细胞悬浮物中加入 7.2 ml 50% PEG3350、1.08 ml 1 mol 乙酸锂、500 μl 携带子单链 DNA ( Origene) 、45 μg DNA 和 900 μl 水。彻底混匀，并每份 360 μl 分装入 30 个微离心管中。在负对照管中加入 1/30 除 DNA 外的上述材料（即 PEG、乙酸锂和携带子 DNA ) ，彻底混匀。

( 4 ) 在 42°C 保育 40 min。在微离心机上以 10000 r/min 转速室温离心 10s，撇去上清液。悬浮每管中的细胞于150 μl 水中。将细胞铺在直径为 15 cm 的筛选平板上（YC Glc trp - ) 上 。30℃ 保育 3 d。

( 5 ) 每皿加入 15 ml 水，用灭菌的盖玻片刮散所有菌斑。把所有细胞悬浮在 500 ml 离心管中，并以 3900 g  ( 4700 r/min，JA-10 转子）离心 5 min。撇除上清液，悬浮细胞于 500 ml 水中。再次离心并撇除上清液。悬浮细胞于 50 ml 水中，并测量 OD₆₀₀ 以确定细胞密度（ 1 OD₆₀₀ 对应于约 2X10⁷ 个/ml ) 。加入甘油至终浓度 15%  ( V/V ) 。分装并保 存细胞悬浮物于 -80°C。

3.2 噬菌体展示库分类

3.2.1 扫视（panning)

( 1 ) 加入 50 μl 涂渍溶液到酶联免疫吸附试验酶标板（Nunc Maxisorp，可分小孔，C-bottom ) 的小孔中（每孔1 μg 的配体）。把酶标板放入一铺有湿纸巾的密封盒子中。保持盒子在 4°C 过夜，或 37°C 1 h。

( 2 ) 用移液器除去液体，并用水清洗小孔两次。加入 360 μl 含 3% BSA 的 TBS 于小孔中。37°C 保育 1 h。为了下一轮实验，制备一对照小孔；加入无配体的缓冲液，并用 BSA 封闭小孔。

( 3 ) 从小孔移除封闭液，用水清洗两次。加入 12 μl 5% BSA 溶液和 50 μl 噬菌体悬浮物（10¹¹ 个/孔）。室温保育 2 h。

( 4 ) 移除噬菌体溶液，然后加入 360 μl TBST。用吸管上下有力地吸动。等待 5 min 然后移除溶液（ 第一轮一次，以后每轮 5 次)。

( 5 ) 在小孔中加入 50 μl 含有 10 μmol/L 配体的 TBST 溶液。37°C 保育 1 h，用吸管上下有力地搅动，回收洗脱物。也可以加 50 μl 酸性洗脱缓冲液到小孔中，室温等待 10 min。用吸管上下有力地搅动。回收第二次洗脱物到装有 3 μl 2 mol/L Tris-碱的微离心管中，准备中和。

( 6 ) 混合 5 ml 新鲜的 XL- 1 Blue  ( OD₆₀₀ 值为 0.5~1；在 LB-Tc 中生长的）和洗脱的噬菌体。对噬菌体，加入 100 ml 2 X YT  [ 和异丙基巯基半乳糖苷（ IPTG ) 直至 1 mmol/L 以得到独体的高产出 ]，并在剧烈摇动的同时，于 37°C 保育 6 h ( 更长的保育时间可能导致独体基因删除）。加入 2 X YT 后立即按 3.1.2 节所描述的测定浓度。对噬粒，混合 5 ml 新鲜的 XL-1 Blue 和洗脱的噬粒，37°C 保育 20 min、加入 100 ml 2 X YT ( 以及 IPTG，如果需要）、100 μg/ml AP 以及 10¹⁰ 个/ml 的辅助噬菌体 KO7；在 37°C 保育 2 h 并保持有力地摇动。Km 至终浓度 70 μg/ml 并保育过夜。保育 20 min 后立即按 3.1.1 节描述测定浓度。按 3.1.1 和 3.1.2 节所述，分 离噬菌体（或噬粒)。重复整个步骤，直至洗脱的噬菌体（或噬粒）数增加。 


3.2.2 单噬菌体克隆的鉴定

( 1 ) 从单克隆中制备噬菌体（或噬粒)。对噬粒，在 2 ml LB-Ap 上过夜生长一单菌落。混合 20 μl 培养液、2 ml LB-Ap  ( 和 IPTG，如愿意的话）和 10¹⁰ 个/ml 辅助噬菌体 KO7。37°C 剧烈摇动保育过夜。对噬菌体克隆，用灭菌的牙签接触一单菌斑。将牙签放在 2 ml 含 100 μl 新鲜 XL-1 Blue 的 LB-Ap ( 和 IPTG，如果需要的话）中，37°C 剧烈摇动保育 6 h。按 3.1.1 和 3.1.2 节所述，制备噬菌体（或噬粒)。

( 2 ) 对每一个要测试的克隆，完成 3.2.1 节的第 （1 ) 和第 （2 ) 步，来准备一带有固定目标分子的小孔。同时用不含目标分子的涂渍溶液涂渍，来制备另一对照用小孔（见注6 )。

( 3 ) 加入 5 μl 5% BSA 溶液和 50 μl 从单克隆制备的噬菌体悬浮液到配体涂溃的和对照的小孔中。视相互作用强弱，调节噬菌体浓度（典型值：每孔 10⁸~10¹¹ 个）。在搅拌 器上室温保温 2 h。

( 4 ) 用 TBST 冲洗 5 次。用喷水瓶在所有小孔中加入 TBST，然后清除液体，将平板翻转面朝下拍在一叠纸巾上。

( 5 ) 在每一个孔中，加入 50 μl 抗噬菌体-辣根过氧化物酶的抗体溶液（Phamacia; 在 TBST : BSA 中稀释1 : 2000)， 在搅拌器上室温保温 1 h。用 TBST 清洗 5 次。

( 6 ) 加入 50 μl 1step turbo-TMB (Pierce) ，等待约 10 min 直到蓝色显现，并加入 50 μl 2 mol/L 硫酸以终止反应 （ 使用有滤嘴的枪尖以保护移液器）。用平板读出器测量 OD₄₅₀。选择对配体涂渍的小孔有高亲和力并对对照小孔呈低亲和力的克隆，以备进一步检测（测序、亲和力优化和蛋白质生产）。

3.3 酵母双杂交筛选

3.3.1 目标（“诱饵”）质粒的制备

在 pEG202 中克隆诱馆基因，使得诱饵与 LexA 在同一可读框表达。重要的是确认 LexA- 诱饵自己不激活报告基因，也不与野生型 FNfn10 相互作用。用相互作用交配法，这很容易测试 [13，19 ] 。

( 1 ) 用 LexA-诱饵质粒 [ 或 pEG202 作负对照，pBait (Origene) 作正对照 ] 和 pSH18-34 ( β-半乳糖苷酶报告质粒；Origene) 转化 RFY206，并在 YC Glc his- ura- 平板上选择。也 用 pYesTrp2 ( 激活子 B42 质粒；Invitrogen )、pTarget  (正对照；Origene ) 或 pYT45 转化 EGY48，并在 YC Glc trp-平板上选择。

( 2 ) 在 YC Glc his-ura- 平板上两个菌斑的每一个上用 LexA 质粒和报告质粒上平行划痕。在 YC Glc  trp - 平板用 B42 质粒以同样的方式划痕。30°C 保育两块平板 1~2 d。

( 3 ) 复制两块平板至一 YPD 平板。从两块板上来的划痕应该互相垂直，以使 EGY48 细胞和 RFY206 细胞在交叠处杂交。30°C 保育过夜。

( 4 ) 将 YPD 平板复制至 YC Glc leu- his- trp - ura、YC Glc his- trp- ura- 和  YC Gal Raf leu- his- trp - ura- 平板，并在 30°C 保育 3 d。所有杂交细胞应该在 YC Glc his- trp - ura- 平板上生长。在 YC Gal Raf leu - his- trp - ura- 平板上的生长指示“诱饵”和 “捕食者” 的相互作用。其他平板用于对照。

3.3.2 酵母双杂交库筛选

含有诱饵的 RFY206 与含有独体库的 EGY48 杂交，并选出含有独体和诱饵的细胞。酵母杂交的应用，使得可以有效地筛选多个库 [13] 。

( 1 ) 在 30°C，10 ml YC Glc his - ura- 培养基中，生长 16 h 驻有 pSH18-34 和 LexA-诱饵质粒的 RFY206。

( 2 ) 用 1.0 OD₆₀₀= 2.0 X 10⁷ 个细胞/ml 换算，通过 OD₆₀₀ 测定细胞浓度。10⁸ 个诱饵细胞放在微离心管中以 10000 r/min 的转速在微离心机上离心 30 s，使细胞旋转沉降，用 200 μl 培养基让细胞悬浮。

( 3 ) 加入 10⁷ 个驻有独体的 EGY48 细胞到诱饵细胞中（见 3.1.7 )，并在 YP 平板上铺开。让细胞杂交 16 h。

( 4 ) 用 5 ml ( 每次用 1 ml)  YPD 培养基将细胞从平板上冲洗下来。100 倍稀释后测量 OD₆₀₀，将 10⁸ 个细胞铺在 5 个 YC Gal  Raf  leu- his- trp - ura- 培养基平板上。于 30°C 保育这些平板 3~4 d。

( 5 ) 复制菌落到  YC Gal  Raf  leu- his- trp - ura- 培养基平板和 YC  Gal leu- his- trp - ura-培养基平板上。保育 16~24 h。真的正克隆将只会在 YC Gal  Raf  leu- his- trp - ura- 平板上生长。

( 6 ) 在通风厨内，打开平板盖，加入足够氯仿以覆盖板表面。5 min 后将氯仿倒入废物罐，并让剩余的氯仿挥发 10 min [ 20 ]。

( 7 ) 在微波炉内加热琼脂糖 -磷酸盐溶液（每皿 10 ml ) ，以溶解琼脂糖，在水浴中冷却到 50°C。在试管中加入 35 μl 50 mg/ml  X-gal 溶液和 10 ml 琼脂糖-磷酸盐溶液，搅拌，并倒入平板中。30°C 保育。观察颜色。挑出呈现蓝色的克隆以备进一步检验。

3.3.3 分离独体的特异性检测

( 1 ) 于 30°C，在 1.5 ml YPD 培养基中，培养从库中筛选出来的感兴趣的酵母细胞 16 h，并用 Y- DER 酵母 DNA 抽提试剂盒（Pierce) 从酵母细胞中制备 DNA。

( 2 ) 将透析后的酵母 DNA 用电穿孔注入大肠杆菌 KC8 细胞（见 3.1.4)，并在 LB-Ap 平板上挑选转化细胞。

( 3 ) 在基本 trp-Km 平板上复制菌落，并于 37°C 保育。选取两个菌落分别接种于 2 ml LB-Ap 培养基中，于 37°C，培养 10 h，并用标准方法抽提质粒 DNA。生长超过 10 h 的 KC8 细胞常产生不纯的质粒。用标准的 DNA 测序法测定独体片段的序列（见注 7 )。

( 4 ) 用 B42-独体质粒转化 EGY48，并用相互作用杂交法测定其与各种诱饵的相互作用（见  3.3.1)。

3.3.4 液相 β-半乳糖苷酶测试

生化测量之前，诱馆与独体的亲和力可用液相 β-半乳糖苷酶测试半定量地加以确定。这个方法比 3.3.2 小节描述的平板测试更为定量。我们改进了这个方法使之适用于 96 孔平板格式（见注 8 )。

( 1 ) 用 pSH18-34、LexA- 诱饵质粒（pEG202 的衍生物）和 B42 独体质粒 ( pYesTrp2 衍生物）转化 RFY206 酵母菌株。把一个菌落接种至 2 ml YC Glc his- ura-trp -，于 30°C 摇动过夜。

( 2 ) 稍稍离心以移除培养基，在温热的 YC Glc his- ura-trp- 中悬浮直至 OD₆₀₀ 值为 0.2。于 30°C 摇动 6 h。测 定 OD₆₀₀ 值并以每 350 μl 装入微离心管中。典型地，我们每次测量三遍。

( 3 ) 将 2 X β-半乳糖苷酶测试溶液与 Y-Per ( Pierce) 按 1 : 1 混合作为工作溶液。加 350 μl 工作溶液到每个样品中。多次翻转以混合。

( 4 ) 30°C 保育，同时检查颜色。当呈现黄色时，加 300 μl 0.5 mol/L 碳酸钠入离心管，并彻底混合。以最大速度离心微离心管 1 min。测定上清液的 OD₄₂₀ 值。

3.4 独体的克隆、表达、纯化和生物素化

当从库中筛选出具有所期望特性的独体后，其基因转染至大肠杆菌表达载体，独体则被表达纯化为一分离的蛋白质。我们在典型情况下每升培养液得到 10~15 mg 独体。我们也描述了为在免疫化学应用中便于探测而使独体生物素化的操作步骤。

3.4.1 独体的克隆

用寡核苷酸 NdeMetThrFNF(5'-CGGGATCCCATATGCAGGTTTCTGATGTTCCGACCGACCTGGAAGTTGTTGCTG-3'；它包含  Arg6 到 Thr 的突变）和 FNGKKGKR ( 5’-CCG ACTCGAGTTACTATTTACCTTTTTTACCGGTACGGTAGTTAATCGAG-3'），扩增感兴趣的独体基因，然后用 Nde I 和 Xho I 降解并克隆到用同样的酶降解过的 pET15b (Novagen) 中。通过测序确认表达载体中基因。

3.4.2 独体的表达

此操作步骤适合于 100 ml 培养液，对初步鉴定而言，这样的量应该能产生足够的独体。

( 1 ) 用独体表达载体转化 BL21 ( DE3 ) 细胞（Novagen) ( 见注 9) 。

( 2 ) 接种转化细胞至 10 ml M9-胰蛋白胨-Ap，并在强烈摇动下，于 30°C 保育 10~16 h。

( 3 ) 接种 2 ml 预培养液至预热的 100 ml M9-胰蛋白胨-Ap，并在强烈摇动下于 37°C 保育。当 OD₆₀₀ 值达到 0.7 时，加入 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/L。

( 4 ) 在强烈摇动下于 37°C 保育 3 h 多，并离心收集细胞。细胞可存储于 -20°C，直至使用。

3.4.3 独体的纯化

此操作步骤适合于 100 ml 培养液（见 3.4.2 )。

( 1 ) 悬浮细胞沉淀于 6.4 ml pH 8.0 的 50 mmol/L Tris-氯化氢中。

( 2 ) 加入 64 μl  50 mg/ml 溶菌酶和 128 μl 50 mmol/L PMSF。混合并于 37°C 保育 15 min。超声破碎并悬浮直至不再有高度黏滞性。

( 3 ) 加入 910 μl 40 mol/L 氯化钠。于 4°C 以 27000 g ( 15000 r/min，SS34 转子）离心 10 min。收集上清液。

( 4 ) 将蛋白质溶液放入装载了  0.1 mol/L 氯化镍并用缓冲液 B 平衡过的 Hi-Trap 螯合柱中 （ 1 ml；Amersham-Pharmacia Biotech) 。先用  6 ml 缓冲液 B， 再用  6 ml 含 60 mmol/L 咪唑的缓冲液 B 洗柱。

( 5 ) 用 6 ml 缓冲液 C 洗脱独体。收集 0.5~1 ml 每份的洗脱液到微离心管中。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析洗脱液。

3.4.4 独体的生物素化

我们连接生物素到 Lys 的氨基。这虽然不是位点特异的，但在 C 端的扩展部分成团的 Lys 应该是最易发生的修饰位点。这个方法可用来连接其他的片段，如荧光染料。

( 1 ) 完成 3.4 3 小节中纯化操作的步骤（1 )~( 4 )。

( 2 ) 用 10 ml 缓冲液 D 清洗柱子。

( 3 ) 溶解 1 mg D-生物素- ε - 氨基己酸轻基琥拍酰亚胺脂（BoehringerMannheim) 于 50 μl 二甲基亚砜，并将其稀释至 3 ml 缓冲液 D 中。注射 1 ml 溶液到柱中并于室温黑暗中保温 1 h。再重复反应 2 次。

( 4 ) 用 6 ml 缓冲液 B 洗柱，并按 3.4.3 节第（ 5 ) 步所述洗脱独体。

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