实验原理

1. 将可能含有转化细胞的幼胚盾片置于愈伤诱导培养基上培养产生愈伤组织，诱导培养基中添加 0.5 mg/L 2 ,  4-D 和 10 mg /L AgNO₃。对农杆菌处理过的培养物，培养基中还应加入 2 mg/L 毒莠定和 160 mg/L 特美汀，愈伤组织诱导培养在黑暗条件下进行，同时在这一阶段可加入选择剂 2~6 mg/L 草铵膦。

2. 3 或 4 周后将愈伤组织从诱导培养基转移至第一轮再生培养基，添加  0.1 mg/L  2 ,4 -D、25 mg/L  CuSO₄ 和 5 mg/L 玉米素，并在持续的光照条件下培养。对农杆菌处理过的培养物，还要加入 160  mg/L 特美汀。可在这一阶段加入选择剂草铵膦 2~6 mg/L。

3. 3 或 4 周后评价再生/选择反应。再生的愈伤组织转移至添加了 5 mg/L 玉米素和 2~6 mg/L 选择剂草铵膦的第二轮再生培养基上继续培养 3~4 周。将一半非转基因对照的愈伤组织置于添加有选择剂的再生培养基上培养，另一半则在无选择剂的再生培养基上培养，分别作为选择对照和非选择对照。



4. 3 或 4 周后评价再生反应和选择反应。

5. 为确保降低非转基因细胞（或组织）的混入，只转移具有健壮绿芽或苗的部分至添加有 4~6 mg/L 草铵膦的再生培养基上，在 Magenta 培养盒（Sigma- Aldrich) 中继续培养 3~4 周。

6. 一旦再生苗长到 10~15 cm 长并有适当的根系时，就将这些可能的转基因植株移栽到含有特制土肥的 8 cm 塑料方盆中，并置于转基因封闭温室中生长。

实验材料

幼胚盾片

试剂/试剂盒

2 4-D AgNO3 毒莠定 特美汀 草铵膦 玉米素

仪器/耗材

诱导培养基 再生培养基

实验步骤

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