非肌肉肌动蛋白的纯化
实验原理
实验材料
试剂/试剂盒
仪器/耗材
实验步骤
2x DNA 酶Ⅰ缓冲液：
20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0
1 mmol/L DTT
0.4 mmol/L CaCI2
0.4 mmol/L ATP
抑蛋白酶肽
抑蛋白酶
亮抑蛋白酶肽
抑胃酶肽 A
PMSF
TPCK
50% 甲醛在 DNA 酶柱缓冲液中
0.4 mol/L NH4CI 在 DNA 酶Ⅰ缓冲液中
0.3 mol/L KCl 在 DNA 酶Ⅰ缓冲液中
DNA酶Ⅰ柱缓冲液
2. 准备一个 5~10 ml 的 DNA 酶Ⅰ的亲和柱。
3. 准备一个 0.2 ~1 ml 的 DEAE 柱：用 DNA 酶Ⅰ缓冲液平衡的 DEAE-纤维素。
4. 通过离心收集细胞并用等渗盐溶液（例如 PBS ) 洗去培养液。
5. 在加蛋白酶抑制剂的 DNA 酶柱缓冲液中重悬细胞沉淀物。
6. 用对于感兴趣细胞的标准方法进行细胞匀浆。
7. 用相差显微镜证实超过 99% 的细胞已经裂解了。
8. 100000 g 离心裂解物 45 分钟。
9. 用巴斯德吸管转移上清，避免混入脂肪。
10. 柱子上样：
(1) 上清和用 DNA 酶Ⅰ缓冲液加蛋白酶抑制剂平衡了的 DNA 酶Ⅰ亲和介质混合，并把介质/蛋白混合物倒到一个小杆子中。
(2) 在装填柱子时收集流出液，通过用抗肌动蛋白抗体进行的免疫印迹、DNA 酶Ⅰ抑制分析或 SDS-PAGE 来证实有大量肌动蛋白留在柱子中。
11. 用 2 倍体积含蛋白酶抑制剂的 DNA 酶柱缓冲液洗柱子，然后用含蛋白酶抑制剂和 0.4 mol/L NH4Cl 的 DNA 酶柱缓冲液洗柱子。
12. 用含 50% 甲醛的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗脱肌动蛋白。
13. 立即把 50% 甲醛洗脱液上样到 0.2~1 ml DEAE 柱子上。
14. 用 5 倍体积的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗 DEAE 柱，然后用含 0.3 mol/L KCl 的 DNA 酶Ⅰ柱缓冲液洗脱。分部收集，每管 200 μl。
15. 检测收集液的蛋白浓度，然后混合出峰时的收集液。
16. 加 MgCl2 使浓度为 2 mmol/L ( 这是选用于天然肌动蛋白），以使肌动蛋白聚合，用 SDS-PAGE 分析多肽组成。
产量应该是 5% 左右，所以从湿重 10 g 的细胞指望得到 2.5~5 mg 纯化了的肌动蛋白是合理的。
