从悬浮细胞中制备细胞膜
实验原理
一、用胶原酶/EDTA 释放细胞
1. 用预保温溶液洗涤单层细胞并用胶原酶处理
(1) 预保温溶液洗涤细胞。
预保温溶液：
5 mmol/L EDTA 钠盐溶于 HBSS，不含二价阳离子。
(2) 在单层细胞上加 1% 的胶原酶溶液，在 37℃ 保温 30 分钟，偶尔摇动。
1% 胶原酶：
IV 型胶原酶（Sigma ) 溶解在含 1 mmol/L CaCl2 的 1% 的 BSA/HBSS 溶液中，含 Mg2+，配成 1％ 的胶原酶溶液。溶液经过滤除菌并保存在 -20℃ 直到使用，避免反复冻融。
(3) 加 1 mol/L EDTA 钠盐（pH 8)。使终浓度为 5~10 mmol/L。保温到细胞变圆，通常需要 30 分钟。
(4) 用临床台式离心机 250 g 温和离心 2~3 分钟以收集细胞。室温也可以接受，但最好在 4℃ 进行。开始分离细胞膜之前至少用 HBSS/EDTA 溶液洗涤细胞一次再将细胞均匀地悬浮在小体积（1~2 ml) 的第 2 步中所描述的细胞膜包被缓冲液（PMCB) 中。
2. 准备下列溶液：
30% 的阳离子硅胶贮存液可以根据 Chaney 和 Jacobson (1983) 的方法制备。
3. 取刚刚洗涤过的至少含 5x106 个细胞的来自第一步的单细胞悬液。
4. 用临床台式离心机 900 g 离心 2~3 分钟沉淀细胞，最好在 4℃，温和地将细胞重新悬浮于 1 ml PMCB 缓冲液中。防止细胞破裂。从此刻到第 9 步，如果发生了细胞破裂，细胞器和细胞碎片可能会与细胞膜一同被分离，这是最大的污染源。
5. —滴一滴地将细胞悬浮液加到 5 ml 1% 的阳离子硅胶 PMCB 溶液中，同时在一个 50 ml 的锥形离心管中轻轻混旋溶液。注意是细胞加到阳离子硅胶中而不是硅胶加到细胞中。所有细胞加完后，用 PMCB 缓冲液稀释二氧化硅包被的细胞悬浮液到 20 ml。
6. 900 g 离心 3 分钟沉淀硅胶包被的细胞。弃掉含有二氧化硅的均匀浑浊而不是絮凝状的上清。沉淀物应该致密而不是蓬松的，如果沉淀明显呈絮凝状或蓬松，可能发生了细胞裂解。为了获得最好的结果，细胞在直到第 7 步的任何一个包被阶段，在相差显微镜下观察都应该是完整的。
7. 小心悬浮细胞于 20 ml PMCB，重新于 900 g 离心 3 分钟沉淀细胞，弃掉上清，再小心悬浮细胞于 20 ml PMCB。最后 900 g 离心 3 分钟沉淀细胞，将细胞悬于 1 ml PMCB 中。
8. —滴一滴地将重悬的硅胶包被的细胞加到轻轻混旋着的 5 ml 1 mg/ml PAA/PMCB 溶液中，以便用 PAA 过度包被细胞。用 PMCB 将整个悬浮液稀释到 20 ml。900 g 离心 3 分钟沉淀细胞，弃掉上清，悬浮细胞于 20 ml。
9. 900 g 离心 3 分钟沉淀细胞，弃掉上清。
10. 用振荡器将细胞充分悬浮于 1~5 ml 冰冷的补加了合适的蛋白酶抑制剂的低渗裂解缓冲液中，冰浴 30 分钟，偶尔摇荡。
11. 在 Bounce 匀浆器中用紧密配套的研杵裂解细胞，用显微镜观察一小滴溶液以监控裂解程度。如果细胞看起来抗这种处理的裂解，可能必须用 Parr 气弹的液氮成孔作用 ( Chaney and Jacobs 1983) 或用细胞裂解器来机械裂解。
12. 分离裂解物以获得细胞膜。
(1) 一步分离的方法
① 用等体积 100% 的 Nycodenz 稀释细胞裂解物，将获得的含 50% Mycodenz (比重 1.25) 的稀释物铺到 5 ml 离心管中的 0.5 ml 70% Nycodenz 溶液（比重 1.37) 上用裂解缓冲液加满离心管，裂解缓冲液中的溶质通常使其比重为 1.03。
② 在吊桶式转头（如 Beckman, SW60Ti) 中 60000 g 离心 20 分钟沉淀细胞膜。
③ 阳离子硅胶包被的细胞膜出现在管底的沉淀中。细胞核和完整的硅胶包被的细胞在 50%/70% Nycodenz 的交界面，细胞质蛋白通常悬浮在 50% Nycodenz 溶液中，内膜通常漂浮在 50% Nymdenz 与裂解缓冲液的交界面。如果要从 50% Nycodenz 与裂解缓冲液的交界面收集内部蛋白，可以用 4 倍体积的裂解液稀释后 60000 g 离心 60 分钟以沉淀之。细胞膜如第 11 步描述的那样收集。
(2) 两步分离方法
① 裂解后（第 9 步），900 g 离心 10 分钟沉淀阳离子硅胶包被的细胞膜。沉淀将包栝硅胶包被的密度大的细胞膜片和细胞核，上清中包括内膜片和可溶性蛋白质。内膜可以用高速离心（50000 g) 来收集。
② 重悬沉淀于 4 ml 裂解缓冲液中并铺于 70% 的 Nycodenz 溶液上。在吊桶式转头 ( 如 Beckman，SW60Ti) 中 28000 g 离心 30 分钟。硅胶包被的细胞膜很容易经过 70% 的 Nycodenz 溶液而沉淀下来，并照第 11 步描述的那样收集。
13. 小心去除所有上清以解收集管底沉积的硅胶包被的细胞膜。硅胶包被的细胞膜几乎看不到，但加 1 ml 裂解缓冲液后就会明显见到玻璃状灰白色的沉淀。重悬沉淀于 1 ml 裂解缓冲液中。
14. 将重悬的硅胶包被的细胞膜转移到 5 ml 锥形离心管中，至少三次用 1 ml 裂解缓冲液洗涤沉淀。如果下一步要确定蛋白质浓度，必须完全去掉 Nycodenz，Nyrodenz 强烈干扰几种蛋白质浓度定量方法，包括 Lowry 法和双缩脲法。这时分离的细胞膜可以用于要求非变性蛋白质的生化分析。
15. 在 2% SDS 溶液中煮沸硅胶包被的细胞膜 5 分钟以溶解膜蛋白。如果煮沸之前先将沉淀均匀悬浮于含 2% SDS 的裂解缓冲液中并用超声波简短处理沉淀，每间隔 6 秒超声 10 秒钟，共超声处理 5 次。会获得最佳蛋白产量。
16. 用微型离心机高速离心 10 分钟沉淀任何残留的二氧化硅。
17. 取出上清，其中含有溶解的细胞膜蛋白，去掉二氧化硅沉淀。
实验材料
仪器/耗材
实验步骤
一、用胶原酶/EDTA 释放细胞
1. 用预保温溶液洗涤单层细胞并用胶原酶处理
(1) 预保温溶液洗涤细胞。
预保温溶液：
5 mmol/L EDTA 钠盐溶于 HBSS，不含二价阳离子。
(2) 在单层细胞上加 1% 的胶原酶溶液，在 37℃ 保温 30 分钟，偶尔摇动。
1% 胶原酶：
IV 型胶原酶（Sigma ) 溶解在含 1 mmol/L CaCl2 的 1% 的 BSA/HBSS 溶液中，含 Mg2+，配成 1％ 的胶原酶溶液。溶液经过滤除菌并保存在 -20℃ 直到使用，避免反复冻融。
(3) 加 1 mol/L EDTA 钠盐（pH 8)。使终浓度为 5~10 mmol/L。保温到细胞变圆，通常需要 30 分钟。
(4) 用临床台式离心机 250 g 温和离心 2~3 分钟以收集细胞。室温也可以接受，但最好在 4℃ 进行。开始分离细胞膜之前至少用 HBSS/EDTA 溶液洗涤细胞一次再将细胞均匀地悬浮在小体积（1~2 ml) 的第 2 步中所描述的细胞膜包被缓冲液（PMCB) 中。
2. 准备下列溶液：
30% 的阳离子硅胶贮存液可以根据 Chaney 和 Jacobson (1983) 的方法制备。
3. 取刚刚洗涤过的至少含 5x106 个细胞的来自第一步的单细胞悬液。
4. 用临床台式离心机 900 g 离心 2~3 分钟沉淀细胞，最好在 4℃，温和地将细胞重新悬浮于 1 ml PMCB 缓冲液中。防止细胞破裂。从此刻到第 9 步，如果发生了细胞破裂，细胞器和细胞碎片可能会与细胞膜一同被分离，这是最大的污染源。
5. —滴一滴地将细胞悬浮液加到 5 ml 1% 的阳离子硅胶 PMCB 溶液中，同时在一个 50 ml 的锥形离心管中轻轻混旋溶液。注意是细胞加到阳离子硅胶中而不是硅胶加到细胞中。所有细胞加完后，用 PMCB 缓冲液稀释二氧化硅包被的细胞悬浮液到 20 ml。
6. 900 g 离心 3 分钟沉淀硅胶包被的细胞。弃掉含有二氧化硅的均匀浑浊而不是絮凝状的上清。沉淀物应该致密而不是蓬松的，如果沉淀明显呈絮凝状或蓬松，可能发生了细胞裂解。为了获得最好的结果，细胞在直到第 7 步的任何一个包被阶段，在相差显微镜下观察都应该是完整的。
7. 小心悬浮细胞于 20 ml PMCB，重新于 900 g 离心 3 分钟沉淀细胞，弃掉上清，再小心悬浮细胞于 20 ml PMCB。最后 900 g 离心 3 分钟沉淀细胞，将细胞悬于 1 ml PMCB 中。
8. —滴一滴地将重悬的硅胶包被的细胞加到轻轻混旋着的 5 ml 1 mg/ml PAA/PMCB 溶液中，以便用 PAA 过度包被细胞。用 PMCB 将整个悬浮液稀释到 20 ml。900 g 离心 3 分钟沉淀细胞，弃掉上清，悬浮细胞于 20 ml。
9. 900 g 离心 3 分钟沉淀细胞，弃掉上清。
10. 用振荡器将细胞充分悬浮于 1~5 ml 冰冷的补加了合适的蛋白酶抑制剂的低渗裂解缓冲液中，冰浴 30 分钟，偶尔摇荡。
11. 在 Bounce 匀浆器中用紧密配套的研杵裂解细胞，用显微镜观察一小滴溶液以监控裂解程度。如果细胞看起来抗这种处理的裂解，可能必须用 Parr 气弹的液氮成孔作用 ( Chaney and Jacobs 1983) 或用细胞裂解器来机械裂解。
12. 分离裂解物以获得细胞膜。
(1) 一步分离的方法
① 用等体积 100% 的 Nycodenz 稀释细胞裂解物，将获得的含 50% Mycodenz (比重 1.25) 的稀释物铺到 5 ml 离心管中的 0.5 ml 70% Nycodenz 溶液（比重 1.37) 上用裂解缓冲液加满离心管，裂解缓冲液中的溶质通常使其比重为 1.03。
② 在吊桶式转头（如 Beckman, SW60Ti) 中 60000 g 离心 20 分钟沉淀细胞膜。
③ 阳离子硅胶包被的细胞膜出现在管底的沉淀中。细胞核和完整的硅胶包被的细胞在 50%/70% Nycodenz 的交界面，细胞质蛋白通常悬浮在 50% Nycodenz 溶液中，内膜通常漂浮在 50% Nymdenz 与裂解缓冲液的交界面。如果要从 50% Nycodenz 与裂解缓冲液的交界面收集内部蛋白，可以用 4 倍体积的裂解液稀释后 60000 g 离心 60 分钟以沉淀之。细胞膜如第 11 步描述的那样收集。
(2) 两步分离方法
① 裂解后（第 9 步），900 g 离心 10 分钟沉淀阳离子硅胶包被的细胞膜。沉淀将包栝硅胶包被的密度大的细胞膜片和细胞核，上清中包括内膜片和可溶性蛋白质。内膜可以用高速离心（50000 g) 来收集。
② 重悬沉淀于 4 ml 裂解缓冲液中并铺于 70% 的 Nycodenz 溶液上。在吊桶式转头 ( 如 Beckman，SW60Ti) 中 28000 g 离心 30 分钟。硅胶包被的细胞膜很容易经过 70% 的 Nycodenz 溶液而沉淀下来，并照第 11 步描述的那样收集。
13. 小心去除所有上清以解收集管底沉积的硅胶包被的细胞膜。硅胶包被的细胞膜几乎看不到，但加 1 ml 裂解缓冲液后就会明显见到玻璃状灰白色的沉淀。重悬沉淀于 1 ml 裂解缓冲液中。
14. 将重悬的硅胶包被的细胞膜转移到 5 ml 锥形离心管中，至少三次用 1 ml 裂解缓冲液洗涤沉淀。如果下一步要确定蛋白质浓度，必须完全去掉 Nycodenz，Nyrodenz 强烈干扰几种蛋白质浓度定量方法，包括 Lowry 法和双缩脲法。这时分离的细胞膜可以用于要求非变性蛋白质的生化分析。
15. 在 2% SDS 溶液中煮沸硅胶包被的细胞膜 5 分钟以溶解膜蛋白。如果煮沸之前先将沉淀均匀悬浮于含 2% SDS 的裂解缓冲液中并用超声波简短处理沉淀，每间隔 6 秒超声 10 秒钟，共超声处理 5 次。会获得最佳蛋白产量。
16. 用微型离心机高速离心 10 分钟沉淀任何残留的二氧化硅。
17. 取出上清，其中含有溶解的细胞膜蛋白，去掉二氧化硅沉淀。
