用流式细胞术检测血小板相关抗体_实验⽅法

实验原理

一种能够通过胎盘存在于血小板表面的免疫球蛋白，被称为血小板相关抗体（PA-IgG）。

实验步骤

一、试剂

洗涤缓冲液（PBS/EDTA/BSA），PBS 缓冲液，含 10 mmol/L EDTA 和 0.5% BSA。

抗体：羊 F（ab⁺）₂ 抗-人 IgG（Fc Sp）-R-PE（H10104，Caltag 为多克隆抗体）。

阴性对照：羊 F（ab⁺）₂ 2 IgG-PE（11304，Caltag）。

二、样本

正常人血样 1 份，血小板数值在正常范围，具体数目不详。

患者血样 2 份，为 1 个月龄的双胞胎患者 1 和患者 2，均为贫血血小板，具体数目不详。

三、步骤

1. 用含 EDTA 抗凝剂的血液收集管采血，3 个血样均取 2 ml，分别加到 3 支流式标准管中。

2. 离心 500 r/min，将上清（富血小板血浆）转到另外 3 支流式标准管中。

3. 离心 2500 r/min 3 min。吸去血浆，用与血浆等体积的洗涤缓冲液重悬血小板。如果必要，可用旋涡混合器混匀。

4. 用洗涤缓冲液洗涤血小板 3 次，每次离心 2500 r/min 3 min。

5. 适量洗涤缓冲液重悬血小板，用血球计数仪测定血小板的浓度，其中正常血样血小板计数为 2000 /ul，患者 1 的血小板数为 6000 /ul，患者 2 的血小板数为 7000 /ul（稀释浓度）。

6. 每个含重悬血小板的流式标准管分为两管。A 管为检测管，B 管为阴性对照管，共 6 只管。正常人血样分别取 250 ul 于 2 支流式标准管（A 管和 B 管）中，每管血小板总数为 5x10⁶。分别取 80 ul 患者 1 的血样于 2 支流式标准管（A 管和 B 管）中，每管血小板总数为 4.8x10⁶。分别取 70 ul 患者 2 的血样于 2 支流式标准管（A 管和 B 管）中，每管血小板总数为 4.9x10⁶。

7. 将上述 6 支流式标准管，于 A 管均加 5 ul 羊 F（ab⁺）₂ 抗-人 IgG（Fc Sp），B 管均加 5 ul 羊 F（ab⁺）₂ IgG。

8. 室温，避光孵育 15 min。用洗涤缓冲液再洗 1 次，方法同步骤 4。

9. 去上清，加 0.5 ml 洗涤缓冲液重悬，上机分析。

实验方法

用流式细胞术检测血小板相关抗体