用随机寡核苷酸引物从mRNA合成cDNA探针_实验⽅法

实验原理

本方案以 poly(A)⁺ RNA 作为模板，通过随机引物反应合成 cDNA 探针，这类探针可用于 cDNA 文库的差异筛选。

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液与溶液

乙酸铵（10 mol/L）

DTT (1 mol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

乙醇

HCl ( 2.5 mol/L)

NaOH ( 3 mol/L)

酚：氯仿（1:1，V/V）

胰 RNA 酶抑制剂（20 单位/μl )

SDS ( 10% m/V)

Tris-Cl ( 1 mol/L，pH 7.4)

2. 酶和缓冲液

反转录酶

10X 反转录酶缓冲液

3. 核酸与寡核苷酸

含有 dATP、dGTP 和 dTTP 各 20 mmol/L 的 dNTP 溶液

dCTP ( 125 μmol/L)

长度为六或七个碱基的随机脱氧核苷酸引物

模板 mRNA

4. 放射性化合物

[α-³²P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性为 >3000 Ci/mmol)

5. 专用设备

冰水浴

Sephadex G-50 离心柱，平衡于 TE（pH 7.6）

预热至 45℃、68℃ 和 70℃ 的水浴或加热板

二、方法

1. 将 1 μg poly(A)⁺RNA 转移至消毒的微量离心管。用无 RNA 酶的水将溶液的体积调至 4 μl。盖紧微量离心管盖，于 70℃ 加热 5 min，然后迅速将离心管转至冰水浴中。

2. 在微量离心管的冷溶液中加入：

10 mmol/L DTT                                    2.5 μl

胎盘 RNA 酶抑制剂                              20 单位

随机脱氧寡核苷酸引物                          5 μl

10X 反转录缓冲液                                 2.5 μl

20 mmol/L dGTP、dATP 和 dTTP 溶液 1 μl

125 μmol/L dCTP 溶液                          1 μl

10 mCi/ml [α-³²P] dCTP

( 比活性为 > 3000 Ci/mmol)                  10 μl

无 RNA 酶的水                                     加至 24 μl

反转录酶（200 单位）                          1 μl

3. 加入下列试剂以终止反应：

0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0)                1 μl

10% （m/V）SDS                          1 μl

充分混合管中的试剂。

4. 在反应管中加入 3 μl 3 mol/L NaOH，68℃ 温育混合物 30 min 以水解 RNA。

5. 使反应混合物的温度冷却至室温，加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl（pH 7.4）以中和溶液，混匀，然后加入 3 μl 2.5 mol/L HCl。取极小量液体滴在 pH 试纸上，以检测溶液的 pH。

6. 用酚：氯仿抽提纯化 cDNA。

7. 用离心柱层析或在 2.5 moI/L 醋酸铵存在下用乙醇选择性地沉淀放射性标记的探针以与未掺入的 dNTP 分离。

8. 用三氯乙酸（TCA）沉淀法或 DE-81 滤膜结合法来确定放射性标记 dNTP 掺入的比例。

实验方法

用随机寡核苷酸引物从mRNA合成cDNA探针