随机引物法(利用寡核苷酸延伸法标记DNA放射性)
实验原理
试剂/试剂盒
实验步骤
1. 缓冲液和溶液
醋酸氨（10 mol/L）
乙醇
NA 终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS）
5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。）
2. 酶和缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段
3. 凝胶
碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶
4. 核酸和寡核苷酸
含三种未标记的 dNTP 溶液（各 5 mmol/L)
长度为六或七个碱基的随机脱氧核苷酸引物（125 ng/μl TE，pH 7.6）
模板 DNA ( 5~25 ng/μl TE，pH 7.6）
5. 放射性复合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 >3000 Ci/mmol）
6. 专用设备
预热至 95℃ 的沸水浴或加热板
微量离心管（0.5 ml )
SephadexG-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡
二、方法
1. 在一个 0.5 ml 的微量离心管中加入溶于 30 μl 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 μl 随机脱氧核苷酸引物（约 125 ng）。盖紧微量离心管，置于沸水浴中 2 min。
2. 将微量离心管移至冰上放置 1 min，4℃ 下离心 10s 使引物与模板的混合物沉降至管底，将微量离心管重新置于冰上。
3. 在引物与模板的混合物中加入：
5 mmol/L dNTP 溶液 1 μl
5X 随机引物缓冲液 10 μl
10 mCi/ml [α-32P] dNTP 5 μl
( 比活性 3000 Ci/mmol）
水 加至 50 μl
4. 加入 5 单位（约 1 μl）的 Klenow 片段，轻弹管壁以混合各组分。以最大速度离心 1~2s 使所有液体沉降到管底。反应混合物室温下反应 60 min。
5. 在反应液中加入 10 μl NA 终止/贮存缓冲液，可根据需要进行以下步骤。
贮存放射性标记的探针于 -20℃ 以备杂交用。
或
通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的 dNTP 或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的 DNA。如果 >50% 的放射 性 dNTP 已在反应中掺入，可不进行该步骤。
