cDNA 3'末端的快速扩增（3’-RACE)_实验⽅法

实验原理

在用 oligo (dT) 引物构建的 cDNA 文库中，偶而发生部分 cDNA 克隆缺失了与靶 mRNA 3' 末端互补的序列。这部分序列到底是在 cDNA 合成过程中还是在分子克隆中怎样缺失和在哪个环节中缺失的尚不清楚。第一链 cDNA 的随机断裂，在合成第二链 cDNA 过程中 DNA 聚合酶不能抵达模板链的末端，引导序列内部的 poly (A) 序列或在分子克隆过程中 poly (dA:dT) 序列附近的 3' 序列的缺失等都是可能造成 3' 末端序列缺失的原因。在用随机六核苷酸引物构建的 cDNA 基因文库中，也存在部分的 cDNA 克隆缺失了 3' 末端序列，这是因为这种随机引物能与靶 mRNA 的许多位点复性结合所致。

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液与溶液

10X 扩增缓冲液

氯仿

4 种 dNTP 贮存液（20 mmol/L，pH 8.0)

胎盘 RNase 抑制剂（20 单位/μl）

TE ( pH 7.6)

2. 酶与缓冲液

反转录酶（RNA 依赖的 DNA 聚合酶）

5X 反转录酶缓冲液

热稳定 DNA 聚合酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶

4. 核苷酸与寡核苷酸

接头引物（10 μmol/L, 5' GACTCGAGTCGACATCG3' ) 溶于水中（10 pmol/μl）

（接头引物可以与基因特异性正向引物联合在一起用于扩增特异性靶 cDNA。第一步 PCR 扩增后，PCR 目的产物可能仅占总 DNA 产物的 1%，也可能多至占总 DNA 产物的 100%。如果必要，可用第一轮 PCR 产物作模板进行第二轮嵌套式 PCR，改善目的产物的产率，该轮 PCR 的引物为接头引物与另一个基因特异性正向引物。在第二轮嵌套式 PCR 扩增后，几乎所有的扩增产物在 EB 染色下呈现了靶 mRNA 的 5' 区域序列相一致的条带。

RT-PCR 的引物用自动 DNA 合成仪合成，用于标准 RT-PCR的引物一般不需要进一步纯化。然而，如果寡核苷酸引物经商品化的树脂进行柱层析纯化（如 NENLife- Science 公司产品 NENSORB)或者经变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，纯化后的引物用于扩增低丰度的 mRNA 时常常会更有效。）

（dT)₁₇-接头引物（10 μmol/L，5'GACTCGAGTCGACATCGA(T)173'）溶于水中（10 pmol/μl)

基因特异性反义寡核苷酸引物（10 μmol/L) 溶于水（10 pmol/μl）。

（基因特异性反义寡核苷酸引物应该与靶 mRNA 的已知序列互补，其长度在 20~ 30 bp，内含的 4 种碱基数量基本相等，G 与 C碱基的平衡分布以及引物具有较低的自发形成稳定二级结构的倾向。）

总 RNA（100 μg/ml）或 poly (A)⁺ RNA（10 μg/ml）溶于水中

（总 RNA一般用离液剂（chaotropic agents) 从细胞中抽提的，选择总 RNA 作模板一般适用于从中等程度到高丰度 mRNA 中通过 RT-PCR 克隆靶基因。对于低丰度靶 mRNA 的样品最好选择 poly (A) ⁺ RNA 作模板进行 RT-PCR。运用作为 RT-PCR 模板的 RNA 也可以从如下的少量培养细胞中制备。）

5. 特殊设备

自动微量移液器的屏蔽型枪头

微量离心管（0.5 ml，薄壁扩增反应专用离心管）或微量滴定板

正向排液式移液器

PCR 仪

水浴箱预设水温在 75℃

二、方法

反转录

在实验开始时，首先要确定 3'-RACE 是否成功。如果反转录步骤是有效的，那么分离到含有靶 mRNA 的 3' 末端序列的克隆的几率是高的。另一方面，如果反转录步骤是无效的，那么本方案的后续步骤是无法弥补的。因此，对于反转录反应条件是值得花时间优化的，如最佳的引物与模板比例，改变反应体系 Mg²⁺ 浓度，寻找最适的 Mg²⁺浓度。

1. 转染 1 pg 至 100 ng 的 poly （A）⁺ RNA 或 1 μg 总 RNA 到一只新的离心管。用水调整体积至 10 μl。将 RNA 样品在 75℃ 变性 5 min，将离心管迅速插入冰中冷却。

2. 向含有这种变性的 RNA 样品的离心管内依次加入如下试剂：

5X 反转录酶缓冲液                      10 μl

20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液               1.5 μl

10 μmol/L (dT)₁₇-接头引物（80 pmol） 8 μl

约 20 单位/μl 胎盘 RNase 抑制剂          1 μl

100~200 单位/μl 反转录酶                    1 μl

H₂O 补足至                                         50 μl

反应管温育在 37℃ 反应 60 min。设置 3 支阴性对照管。在一支对照管中加入合成第一链 cDNA 反应所需的所有试剂，但不加模板 RNA；第二支对照管加入除了反转录酶外的所有试剂；第三支对照管中加入除引物外的所有试剂。这些对照管进行所有的后续步骤。设置这些对照管能保证 cDNA 产物的不是由于污染或由 RNA 的自身引导所致。

3. 用 TE ( pH 7.6 ) 将反转录反应产物（cDNA ) 稀释至终体积为 1 ml。

扩增

4. 按以下次序，将各成分加入到一只 0.5 ml 灭菌离心管、扩增管或灭菌微量滴定板的孔内，建立 PCR 系列反应管：

已稀释 cDNA                                                             0~20 μl

10X 扩增缓冲液                                                  5 μl

20 mmol/L 4 种 dNTP 混合液                                      5 μl

10 μmol/L (dT)₁₇-接头引物（16 pmol）                        1.6 μl

10 μmol/L 接头引物（32 pmol）                                  3.2 μl

10 μmol/L 基因特异性正义寡聚核苷酸引物（32 pmol） 3.2 μl

1~2 单位热稳定 DNA 聚合酶     1 μl

H₂O 补足至                                                                50 μl

如果实验必要，可建立系列的扩增试验管，用于筛选 cDNA 产生最大量的 3' 末端扩增产物的试验管。对照管加入以上除了 cDNA 模板之外的所有试剂，以鉴别模板有无污染。

5. 如果 PCR 仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油（约 50 μl），防止样品在 PCR 反应多个加热与冷却的循环过程中蒸发；如果应用热启动 PCR 程序，在反应混合液上层加一滴石蜡油；放置离心管或微量滴定板在 PCR 仪上。扩增核苷酸的典型程序有变性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：

6. 抽取每种扩增样品 5~10 μl，用琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用判断扩增片段的大小。凝胶一般用 EB ( 溴化乙锭）或 SYBR 金颗粒染色后来观察扩增的量与片段大小。

7. 若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层，反应结束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。

8. 从扩增的 DNA 产物中分离掉残余的热稳定 DNA 聚合酶和 dNTP。

实验方法

cDNA 3'末端的快速扩增（3’-RACE)