PCR产物的平末端克隆
实验原理
实验步骤
1. 缓冲液与溶液
10 mmol/L ATP
2 mmol/L dNTP 溶液(含四种 dNTP)
10X KGB 广域缓冲液(1 mol/L 乙酸钾,250 mmol/L Tris-acetate ( pH 7.6 ),100 mmol/L MgAc ( 含四水化合物),5 mmol/L β-巯基乙醇,100 μg/ml 牛血清白蛋白)
2. 酶与缓冲液
噬菌体 T4 DNA 连接酶
噬菌体 T4 DNA 聚合酶
用于克隆的限制性内切核酸酶
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶
4. 核酸与寡核苷酸
闭环质粒 DNA ( 50 μg/ml)
靶基因 DNA ( 25 μg/ml) 及 PCR 扩增产物
5. 特殊设备
水浴箱预设水温在 22℃
二、方法
1. 在一只微量离心管内,依次加入下列试剂,混匀:
50 μg/ml 闭环质粒载体 1 μl
25 μg/ml PCR 扩增靶 DNA 8 μl
10X KGB 广域缓冲液 2 μl
H2O( 见下面注释) 5 μl
10 mmol/L ATP 1 μl
2 mmol/L dNTP 1 μl
限制性内切核酸酶 2 单位
T4 DNA 聚合酶 1 单位
T4 DNA 连接酶 3 单位
注意:用 H2O 调整终反应体积为 20 μl 反应体系。
设置对照反应管,加入以上除了 PCR 扩增靶 DNA 的所有试剂。
2. 将连接反应混合液离心管在 22℃ 水浴温育 4 h。
3. 将上述两支试管内的连接反应混合液样品各取 5 μl,用 10 μl H2O 稀释后,转化具有抗生素抗性的感受态大肠杆菌受体菌。将这种转化菌液涂布于含适当抗生素和 IPTG 与 X-gal 的培养基的平皿上。
4. 计算实验管与对照管在培养皿上的菌落数。
挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色单菌落进行培养扩增,抽提质粒 DNA,利用质粒多克隆位点内的插入外源 DNA 片段侧翼的酶切位点,用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定;也可以用菌落 PCR 予以鉴定。
5. 通过琼脂糖凝胶电泳测定克隆 DNA 片段的大小(采用合适的 DNA marker 分子量作对照)。
6. 利用 DNA 序列分析、限制性内切核酸酶图谱或 Southern 杂交进一步鉴定克隆的靶基因 DNA 片段的正确性。