用一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

氯仿

乙醇
 
异丙醇

液氮

单相裂解试剂



磷酸缓冲盐溶液（PBS), 冰冷

RNA 沉淀液（1.2 mol/L NaCl，0.8 mol/L 柠檬酸二钠盐·15H₂O（不需要调 pH）

乙酸钠（3 mol/L, pH 5.2)

2. 细胞和组织

源细胞或组织

3. 离心机和转头

Sorvall H1000 转头或与之相当的转头

Sorvall SS-34 转头或与之相当的转头

4. 专用设备

测量 260 nm 吸光度的比色杯

匀浆器（如Tekmar-Dohrmann 的组织匀浆器和 Brinkmann 的 polytron 匀浆器）

研钵和研杵

带螺帽的聚乙烯管

水浴，预设定 65℃

二、方法

1. 准备分离 RNA 的细胞或组织样品

(1) 组织

① 解剖所要的组织，将其直接放入液氮中速冻。

② 将 100 mg 冰冻组织放液氮的研钵中，用研杵碾碎组织。在研磨过程中要不断添加液氮以保持组织冷冻。

③ 将粉末状的组织移入一个盛有 1 ml 冰冷单相液的聚乙烯螺帽管中。

④ 于室温用 polymm 匀浆器高速匀浆组织 15~30s。

(2) 悬浮生长的哺乳动物细胞

① 用台式离心机于室温以 200~900 g（Sorvall H1000 转头为 1000~3000 r/min) 离心 5~10 min, 收集细胞。

② 吸出培养液，用 1~2 ml 无菌冰冷的 PBS 重悬细胞沉淀。

③ 离心收集细胞，吸尽 PBS, 每 10⁶ 细胞加 1 ml 单相裂解剂。

④ 于室温，用匀浆器高速匀浆细胞 15~30s。

(3) 单层生长的哺乳动物细胞

① 吸出培养液，用 5~10 ml 无菌冰冷的 PBS 洗涤细胞一次。

② 吸出 PBS, 每个直径 90 mm 培养皿中的培养细胞用 1 ml 单相裂解剂裂解细胞（每个直径 60 mm 培养皿加 0.7 ml 单相裂解剂）。

③ 转细胞裂解液于一螺帽聚乙烯管中。

④ 于室温用匀浆器高速匀浆细胞裂解物 15~30s。

2. 于室温将细胞匀浆物温育 5 min 使核蛋白复合物完全解离。

3. 加入 0.2 ml 氯仿于每毫升单相裂解剂中，通过剧烈摇动或用旋涡震荡器混匀样品。

4. 于 4℃ 以 12000 r/min （Sorvall SS-34 转头 10000 g）离心 15 min 使混合物分为两相， 将上层水相移至一个新的离心管中。

5. 从水相中沉淀 RNA: 每 1 ml 单相裂解剂，加入 0.25 倍体积的异丙醇和 0.25 倍体积的 RNA 沉淀液。充分混匀后，于室温放置 10 min。

6. 于 4℃ 以最大转速离心 10 min 收集 RNA 沉淀。用 75% 的乙醇洗涤沉淀两次，重复上述离心。用一次性使用的吸头吸尽残存的乙醇。将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，让最后残存的痕量乙醇挥发殆尽。不要让 RNA 沉淀干透。

7. 加 50~100 μl DEPC 处理过的水。将 RNA 溶液贮存于 -70℃。

加 SDS 至终浓度 0.5%，然后加热至 65℃ 有助于 RNA 沉淀的溶解。

8. 估计 RNA 的浓度。

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