用缠绕法从哺乳动物细胞中分离DNA_实验⽅法

实验原理

本方法由 Bowtell 法（1987) 改进而成，可同时从许多不同细胞或者组织样品中制备 DNA。本方案中的主要步骤包括将 DNA 沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面上，接着将沉淀的 DNA 缠绕到一个 Shepherd 氏钩上。缠在钩上的 DNA 从乙醇溶液中转出溶于所选择的液体缓冲液。这种收集高分子质量 DNA 沉淀的方法首次用于 20 世纪 30 年代。小片段 DNA 和 RNA 不能有效地整合入凝胶状缠绕物。这些 DNA 往往太小（约 80 kb)，不能用于构建基因组 DNA 文库，但用于 Southern 杂交和聚合酶链反应则效果甚佳，也可用限制性内切核酸酶部分酶解后用于构建按大小进行分级的文库。1 ml 培养的非整倍体哺乳动物细胞（2.0X10⁷ 个，如 HeLa 细胞）能产生 100 μg DNA。

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

细胞裂解液（6 mol/L 盐酸胍，0.1 mol/L 醋酸钠（pH 5.5)）

乙醇（室温）

TE ( pH 8.0)

2. 凝胶

脉冲电场凝胶或 0.6% 琼脂糖凝胶

3. 核酸和寡核苷酸

λ 噬菌体的线性单体和多联体

4. 专用设备

Kimwipe 吸水纸

聚丙烯管（50 ml)

振荡平台

Shepherd 氏钩（替代透析的一种选择）

宽口移液管（开口处直径 0.3 cm)

5. 细胞和组织

单层或者悬浮培养的哺乳类细胞、新鲜组织或血样

二、方法

1. 制备细胞悬液（或冰冻细胞粉末）的裂解液。

2. 采用下面两种方法之一制备细胞裂解液。

(1) 从悬浮培养液裂解细胞

① 将细胞悬液转移至一次性聚丙烯离心管。

② 加 7.5 倍体积细胞裂解液。

(2) 从组织裂解细胞

① 将冰冻细胞粉末一点一点加入盛有约 7.5 倍体积细胞裂解液的烧杯，使其分散于裂解液表面，而后振摇烧杯使粉末浸没。

② 待所有材料溶解，将溶液转移至离心管。

3. 关上离心管盖，室温中在振摇平台上温育 1 h。

4. 在一系列一次性 50 ml 聚丙烯离心管中加入 18 ml 处于室温的乙醇。使用宽口移液管小心地使细胞悬液处于乙醇之下。

5. 用 Shepherd 氏钩缓慢搅拌细胞裂解液和乙醇间的界面以回收 DNA。DNA 将黏附在钩上形成胶状物。继续搅拌直至乙醇和水相完全混合。

6. 将黏附有 DNA 的 Shepherd 氏钩转移至另一含有 5 ml 室温乙醇的聚丙烯管中。将 DNA 浸入乙醇直至完成所有样品。

7. 移出黏附有 DNA 的每个 Shepherd 氏钩，尽量使乙醇滴干。至此，DNA 收缩成紧密的脱水团块。通常将钩的 U 型末端与 Kimwipe 吸水纸接触，便可通过毛细管作用去除大部分游离乙醇。当 DNA 上的乙醇尚未蒸发完全时，将钩转移至另一新的聚丙烯管，里面盛有 5 ml 处于室温的乙醇。

8. 当全部样品处理完毕，尽可能去除乙醇。

9. 将每个吸管转移至盛有 1 mI TE 缓冲液（pH8.0) 的新聚丙烯管中。于 4℃ 过夜，使 DNA 重新水合。

10. 在水合过程中，DNA 将呈高度凝胶状，但仍黏附于吸管上。用另一新 Shepherd 氏钩做刮刀，温和地将 DNA 沉淀从吸管上刮下来。弃去吸管，让 DNA 沉淀漂浮于 TE 中。盖上管盖，于 4℃ 在振摇平台上温育直至 DNA 沉淀完全溶解（约 24~48 h)。

11. 在脉冲凝胶电泳或者 6% 琼脂糖凝胶上分析。

实验方法

用缠绕法从哺乳动物细胞中分离DNA