病毒感染细胞实验
实验原理
病毒包装的原理
质粒DNA为能转录出慢病毒遗传物质（RNA），但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，psPAX2为能表达慢病毒外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， pMD2.G为慢病毒的膜蛋白质粒，通过 lipofectamine2000进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因RNA与psPAX2、pMD2.G基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。
在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA，该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。
实验步骤
构建手段，一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
（1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定
（2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定
二、质粒DNA在大肠杆菌里转化
连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增，然后提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
1.大肠杆菌感受态细胞的制备
（1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于3mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
（2）取0.4ml菌液转接到40mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h
（3）菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min
（4）4℃离心10min（4000r/min）
（5）倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽
（6）用冰浴的0.1mol/L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min
（7）4℃离心10min（4000r/min）
（8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）
（9）分装细胞，200ul一份，4℃保存
2. 质粒DNA的转化
（1）取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min
（2）离心管放到42℃保温90s
（3）冰浴2min
（4）每管加800ulLB液体培养基，37℃培养1h（150r/min）
（5）取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min
（6）倒置平皿37℃，12~16h，出现菌落
3.质粒提取步骤
（1）取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min，弃上清
（2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。
（3）加入250ul溶液Ⅱ（细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
（4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀5-6次，此时会出现白色絮状沉淀。
（5）12000室温离心10min，收集上清。
（6）将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。
（7）12000转离心1min，弃滤液。
（8）加入500ul溶液PB（洗涤液）12000转离心1min，弃滤液，目的是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
（9）加入500ul溶液W（去盐液），12000转离心1min，弃滤液，重复一次。
（10）12000转离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。
（11）将DNA纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加50-100ul溶液Eluent（为无菌的双蒸水，PH为8.0-8.5），室温放置2min。
（12）12000转离心1min，此时管底即为高纯度的质粒DNA，质粒于-20℃保存。
三、质粒DNA和其他包装质粒共转染293T细胞产生病毒（即病毒包装）
共转染的操作步骤
第一天：用无抗生素DMEM+10%FBS铺板293FT细胞，2ml/孔。确保第二天细胞密度达到80%-90%融合度
第二天：
（1）500ul 无血清培养基稀释2ug 表达质粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G
（2） 500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体2000
（3）5min后，将DNA溶液和脂质体溶液混合，室温静止20min
（4）从6孔板中吸出1ml无血清培养基，然后滴加入1ml质粒和脂质体混合物。
（5） 6-10h后，移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以正常培养液DMED+10%FB（从此刻开始算时间）。
第三天：
转染24h后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到70%以上
第四天：
（1）转染后48和72h分别收获含病毒的上清。
（2）3000 rpm 离心20min，0.45um滤膜过滤，去除细胞沉淀。
（3）12000转离心浓缩细胞、分装-80°C贮存。
（4）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
五、慢病毒感染细胞
1、流程图
2、感染步骤
（1）铺板：将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生长过夜
（2）感染：将70-80%铺满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。
（3) 24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。
3、荧光显微镜的操作流程
打开荧光器（30min内不能关闭，否则影响显微镜寿命），细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率。图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。（针对leica）
六、感染后的细胞检测方法
1.荧光初步检测
若有荧光，则表示病毒感染成功，但并不能确定目的基因是否整合到细胞中，待进一步检测，荧光有强弱之分，与病毒加入的量有关。
2.RNA的提取及RT-PCR检测
（1）RNA提取步骤
加1mlTrizol，吹打后移至1.5ml无菌的离心管中；加100ul氯仿剧烈振荡30s混匀，12000转15min，可看到明显分层；取上层透明液体至新的1.5ml离心管中，加等体积的异丙醇，混匀静置10min，12000转离心10min，弃上清，加1ml70%乙醇，12000转，离心10min，弃上清，风干剩余液体，最后加DEPC-水溶解RNA，电泳，粗步判定RNA纯度。
（2）RT-PCR步骤：
RT是一个逆转录的过程，用前一天提取好的总RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR仪的温度设置下，RNA可逆转录为cDNA。
PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下进行复制成双链DNA。（具体步骤省略）
3.蛋白提取及Western检测
western-Bloting：蛋白免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。 第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上， 用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PVDF 膜， 蛋白转移的方法多用电泳转移 （转移电泳） ，它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。
注意事项
2.感染病毒时培养基量少，以保证病毒的浓度，在培养10h左右可根据培养基颜色加培养基。
3.在不明确细胞感染复数情况下，可进行浓度梯度感染，计算细胞感染复数。
4.在加病毒后一般24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体时间根据细胞状态来看。
其他
293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体，可作为生物膜，用于捕获外源性物质后更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。
