琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA的回收（电洗脱至透析袋）

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙醇

EB 或 SYBR Gold 染色液

酚：氯仿（1:1 , V/V)

乙酸钠（3 mol/L, pH 5.2)

0.25X TBE 电泳缓冲液

含 0.5 μg/ml 溴化乙锭的 0.25 X TBE 电泳缓冲液

2. 酶和缓冲液

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

DNA 样品

5. 专用设备

煮过的透析袋

透析袋夹

水平电泳槽

手提式长波紫外灯（302 nm）

二、方法

1. 消化可以获得至少 100 ng 的目的 DNA 片段。在适当浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺中进行电泳分离，用含有 0.5 μg/ml 溴化乙锭或 SYBR Gold 染色。用手提式长波长紫外灯确定所需条带的位置。

2. 用一锋利的手术刀片或剃刀片，切下含有目的条带的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶切片，置于用 0.25X TBE 湿润的方形石蜡膜上。尽可能使切下的琼脂糖体积最小，以减少抑制剂对 DNA 的污染，并缩短 DNA 迁移出凝胶的距离，同时也保证能容易地将其放入透析袋中。

3. 切下条带后，进行照相，以获得洗脱条带的记录。

4. 戴上手套，用透析袋夹将透析袋一端封住。用 0.25X TBE 充满透析袋直至激出，拿住袋颈，轻挤透析袋以打开袋口。用药勺将凝胶切片转移至充满缓冲液的透析袋中。

5. 使凝胶切片沉至袋底。去掉大部分缓冲液，留下足够液体以使凝胶切片始终保持与缓冲液接触。然后就在凝胶切片上方用透析袋夹将袋夹紧，避免存留气泡和夹碎凝胶切片。在透析袋夹上用记号笔标记上 DNA 片段的名字。

6. 把透析袋浸泡在盛有一浅层 0.25X TBE 的水平电泳槽中。用玻璃棒或吸管防止透析袋漂浮，同时使凝胶切片的方向与电极平行。使电流通过透析袋，电压通常为 7.5 V/cm, 持续 45~60 min。用手提式长波紫外灯来监测 DNA 从凝胶切片中迁移出来。

如果电泳时间太短，只有部分的 DNA 从凝胶切片中迁移出来，这样会降低回收率。同样，如果电泳时间太长，则会导致 DNA 附着到透析袋壁上。通常在 0.25X TBE 缓冲液中，电压为 7.5 V/cm, 持续 45~60 min 就可以从凝胶切片将 0.1~2.0 kb 的 DNA 片段洗脱约 85%。



7. 倒转电流的极性电泳 20 s，使 DNA 从管壁上释放下来。切断电源，从电泳槽中取出透析袋，轻揉它以便使 DNA 进入缓冲液。

8. 反向电泳后，打开透析袋夹，小心将凝胶周围的所有缓冲液转移至一个塑料管中。从袋内取出凝胶切片，如步骤 9 介绍的将其染色。用巴斯德吸管吸取少量 0.25X TBE 冲洗透析袋，将洗液加到塑料管中。

9. 将凝胶切片浸入含有溴化乙锭（0.5 μg/ml) 的 0.25X TBE 中，于室温染色 30~45 min。在紫外线下检査凝胶切片，确证全部 DNA 已被洗脱。

10. 通过 DEAE-SepHacel，或用市售树脂层析，或用酚：氯仿抽提和标准的乙醇沉淀纯化 DNA 片段。

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