酵母人工染色体的应用_实验⽅法

实验原理

直到 20 世纪 80 年代中期，尚无技术可用于基因组 DNA 黏性大片段的分离、扩增和分析。在此之前，如果要对某一 DNA 片段进行详细的物理和功能研究，该 DNA 的长度应能够装入 λ 噬菌体颗粒或黏粒载体。

实验材料

酿酒酵母

试剂/试剂盒

甘油

仪器/耗材

脉冲场凝胶电泳仪选择性培养基 YPD 琼脂平板 YPD 培养基试管

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

用 YPD 培养基配制的 30% (V/V) 的甘油

2. 凝胶

脉冲场凝胶电泳仪

3. 培养基

选择性培养基

YPD 琼脂平板

YPD 培养基

4. 专用设备

试管（2 ml )

5. 载体和酵母菌株

携带重组 YAC 克隆的酿酒酵母

二、方法

1. 实验室获得克隆后，立即划线接种于选择培养基中，30℃ 培养 48 h 以获得单个菌落。

2. 挑取 6~12 个单菌落，分别加入 10 ml YPD 培养基中。将培养物在 30℃ 剧烈振荡 ( 300 r/min ) 培养过夜。在此期间，细菌数应达到饱和（OD₆₀₀=2.0~3.0，约为 3 X 10⁷ 个细胞/ml)。

3. 分别从每一培养物中取 9 ml，提取酵母 DNA。

4. 用 PFGE 分析每一个 DNA 产物中 YAC 的大小。

5. 用 Southern 杂交或 PCR 确定 YAC DNA 中存在靶序列。

6. 如果结果满意，即培养液中含有的 YAC 大小相同，没有不稳定或重排的迹象，并且靶序列也存在，则可以选择 1~2 个培养物长期保存。

实验方法

酵母人工染色体的应用