大量培养物中分离 BAC DNA_实验⽅法

实验原理

BAC 重组子的精细分析，包括详细的限制酶切图谱、DNA 测序或亚克隆，所需 DNA 量都超过小量制备所能提供的量。本方案的制备流程适用于重组 BAC 的大规模培养物。500 ml BAC 转化菌的平均产量为 20~25 μg BAC DNA。还可用柱层析对 DNA 产物进一步纯化。

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙醇

异丙醇

酚: 氯仿（1:1, V/V)

DNA 提取液

碱性裂解液Ⅰ，预冷

碱性裂解液Ⅱ

碱性裂解液Ⅲ，预冷

STE 溶液，预冷

TE ( pH 8.0)

2. 酶和缓冲液

溶菌酶

限制性内切核酸酶

3. 核苷酸与寡核苷酸

脉冲场凝胶电泳的 DNA 标准参照物

4. 凝胶

脉冲场凝胶电泳仪

5. 培养基

含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基

6. 离心机与转头

Sorvall GSA 转头或同类产品，备有 Oakridge 管（Nalgene)

7. 专用设备

层析树脂

8. 载体和菌株

BAC 转化的大肠杆菌

二、方法

1. 将 50 μl 过夜培养的饱和 BAC 转化菌接种到 500 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基中，37℃ 剧烈振荡（300 r/min) 培养 12~16 h 至细胞达到饱和。

2. 4℃ 下，2500 g（Sorvall GSA 转头 3900 r/min）离心 15 min，收集细胞，弃上清，倒置离心瓶使最后一滴上清流尽。

3. 用 100 ml 冰预冷的 STE 重新悬浮细菌沉淀。按步骤 2 方法离心收集细菌。

4. 用 24 ml 含无 DNase 的 RNA 酶（100 μg/ml ) 的碱性裂解液Ⅰ溶解细菌。加溶菌酶至终浓度为 1 mg/ml。

5. 加入 24 ml 新鲜配制的碱性裂解液Ⅱ。盖紧离心瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，冰浴 5 min。

6. 加入 24 ml 冰预冷的碱性裂解液Ⅲ，盖紧离心瓶盖，轻轻涡旋离心瓶使内容物完全混匀，至无明显的两相分层现象，置冰上 5 min。

7. 4℃ 下，15000 g（Sorvall GSA 转头 9600 r/min）离心细菌裂解液 10 min，然后将上清转移至另一聚丙烯离心瓶中。弃去离心瓶中的沉淀。

8. 加等体积的酚：氯仿。轻轻翻转离心瓶数次，混匀水相和有机相。室温下 3000 g ( Sorvall GSA 转头 4300 r/min ) 离心 15 min，使两相分离。

9. 用一宽口径吸头将水相移至一新离心瓶中，加入等体积的异丙醇，翻转离心瓶数次，混匀。

10. 在离心瓶的一侧做标记，并且将有标记的一侧放在远离转头中心的一面。此标记有助于接下来确定核酸沉淀的位置。室温下 15000 g ( Sorvall GSA 转头 9600 r/min) 离心 15 min, 回收核酸沉淀。

11. 小心弃去上清，将离心瓶倒立在一纸中上，至最后一滴上清流尽。室温下用 20 ml 70% 乙醇漂洗沉淀和管壁。吸干乙醇，室温下将瓶倒立在一叠纸巾上几分钟，使乙醇挥发殆尽。

12. 小心地将 BAC DNA 沉淀溶于 0.2 ml TE ( pH 8.0) 中。轻弹管壁而不要在涡旋仪上振荡，以促进 DNA 溶解。通过光谱吸收测 DNA 浓度。

13. 用限制性内切核酸酶消化 DNA。

14. 用 PFGE 分析消化的 BAC DNA。电泳要采用适宜大小的 DNA 标准参照物。

实验方法

大量培养物中分离 BAC DNA