GST 融合蛋白沉降技术检测蛋白质
实验原理
实验材料
试剂/试剂盒
实验步骤
缓冲液和溶液
将缓冲液稀释到适当浓度。
裂解缓冲液
20 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
200 mml/L NaCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
0.5% Nonidet P-40
使用前加入蛋白酶抑制剂达到下述终浓度：2ug/ul 抑肽酶（aprotinin)、1ug/ul 白胃素（leupeptin)、0.7ug/ml 胃酶抑素（pepstatin) 及 25ug/ml 苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)
溶于 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中的还原型谷胱甘肽（20 mmol/L)
可选，请见步骤 8。
2xSDS-PAGE 加样缓冲液
凝胶
SDS 聚丙烯酰胺凝胶
关于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的详情请见附录 8。
专用设备
沸水浴
翻转祥品旋转仪
谷胱甘肽琼脂糖球珠
在裂解缓冲液中制成 50% 悬液。
探针
GST 蛋白
带有“诱饵”或探针序列的 GST 融合蛋白
按第 15 章方案 1 描述的方法构建。
细胞和组织
细胞裂解液，其中蛋白质 35S 用标记
根据实验目的和所需检测方法，可用非标记的细胞裂解液。进一步的详情，请见方案介绍。
附加试剂
此方案的步骤 11 需要如附录 8 列出的蛋白质免疫印迹和染色试剂，这些蛋白质是由 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的。
方法
预清除细胞裂解液
1. 将细胞裂解液与 50ul 的 50% 谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和 25ug GST 在 4°C 翻转混合孵育 2 h。需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。开始用相当于 1X106~1X107 个细胞的裂解液。
由于实验的目的是比较 GSTT 与 GST 融合蛋白，有必要对每个反应制备足够量的预清除裂解液。试剂有效地混合是成功的关键。为达到此目的，反应应在一个合理的体积中进行：一个好的起始值是 500~1000ul。
这种预清除步骤是要从裂解液中去除与 GST 成分或球珠有非特异性相互作用的蛋白质。如果相互作用的检测主要是用针对候选相互作用蛋白质的抗体，那么用 GST 或谷胱甘肽琼脂糖球珠做预淸除并不总是必需的。然而，在用 35S 标记的细胞裂解液用于确定新的蛋白质-蛋白质间相互作用时，这些步骤有助于降低本底。如果是用针对候选相互作用蛋白质的抗体来检测相互作用，包含两种对照很重要：GST 加球珠和仅有球珠。
如果相互作用的目的蛋白已知存在于专门的细胞部位. 那么探针应当与对应那种细胞部位的细胞裂解液组分孵育。
2. 在微量离心机上以最大速度在 4°C 离心混合物 2 min。
3. 将上清（就是预清除的细胞裂解液）转移到新的离心管中。
探测细胞裂解液
4. 设定两个含等量预清除细胞裂解液及 50ul 谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在一管中加约 10ug GST 蛋白，另一管中加约 10ug 的 GST 融合探针蛋白。两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应当是等摩尔 (就是说 GST 的终浓度应当与 GST 融合探针蛋白相同）。将离心管在 4°C 翻转混合孵育 2 h。
重要：如果结合蛋白是通过煮沸而从球珠上去除（步骤 10), 那么引入仅含谷胱甘肽琼脂糖球珠和细胞裂解液的对照是重要的，它可检测到与球珠非特异性结合的蛋白质。
5. 在微量离心机上以最大速度离心样品 2 min。
6. 在新的微量离心管中收集上清。这些样品可通过步骤 10 中的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
7. 用1ml 冰冷的裂解液洗球珠。在微量离心机上以最大速度离心 1 min。弃去上清。重复洗三次。
8.(可选）加人 50ul 20 mmol/L 的还原型谷胱甘肽（在 50 mmol/LpH8.0 的 Tris-Cl 中）到球珠中，洗脱 GST 融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在微量离心机上以最大速度离心 2 min。
9. 将球珠（来自步骤 7) 或洗脱蛋白质（来自步骤 8) 与等体积的 2XSDS-PAGE 上样缓冲液混合。
检测相互作用蛋白质
10. 将样品煮沸 4 min 并做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
11. 检测与 GST 融合蛋白结合的蛋白的方法取决于细胞裂解液是否被 35S 标记以及实验的目的。
(1) 如果目的是检测与融合蛋白结合的所有 35S 标记的蛋白，就在干胶仪上将胶抽干，并用 X 线胶片曝光进行放射自显影。
(2) 如果目的是检测特异性结合的蛋白质，就将蛋白质从 SDS 聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上，进行免疫印迹分析（附录 8)。
(3) 如果目的是确定与融合蛋白结合的蛋白质的大小和丰度，而这些蛋白质是来自非放射性的裂解液，就用考马斯亮蓝或硝酸银将胶染色（附录 8）。
