实验方法

cDNA合成技术

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通过体外无细胞系统翻译找出目的基因mRNA以后,变可进行cDNA第一链的合成,其步骤如本文所介绍.

cDNA合成技术

实验原理

cDNA第一链的合成：
1.在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg）,100m mol/L甲基氢氧化汞1μl,室温反应l0分钟,使RNA变性.
2.加100m mol/l的β-巯基乙醇2μl和10m mol/l RNase抑制剂2μl,室温放置5分钟.β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用.
3.向上述反应混合物加lmg／ml的引物01igo dT(12～18聚体)10μl,1mol／l Tris.HCl(pH8.3)5μl,11mol／l, KCl7μl,250m mol／l,MgCl22μl,再加20 m mol／l的4种dNTP各2.5μl,逆转录酶2μl（40单位）,用水补充到50μl,充分混匀,42℃反应1～3小时. 
4.加0.5 EDTA(pH8.0)2μl终止反应,然后加150m mol／l NaOH 25μl,65℃反应1小时,或37℃8小时,水解mRNA模板,得到cDNA第一链,再加pH8.0,1m mol／l Tris.HCl,各25μl中和其pH.
5.测定放射活性,计算合成的DNA量.实际上,cDNA第一链的产量往往不会超过poltAmRNA用量的10%～30%.
6.用等体积的酚-氯仿抽提—次,取水相并用SephadexG-100离心柱层析将cDNA同剩余的dNTP分开,以2.5倍体积的95％冷乙醇沉淀.
7.合成的cDNA第—链在1.4％的碱性琼脂糖凝胶上电泳,用末端标记的pBR322限制性片段为分子量标准,电泳后,铺X-光片,进行放射自显影,确定cDNA第一链的大小. 
 
cDNA第二链的合成：
1.离心沉淀cDNA第一链,并重悬在50μl水中,加50μl 2×第二链缓冲液(0.2mol／l Hepes,pH6.9,20m mol／l MgCl2,5 m mol／l DTT,0.14 mol／l KCl,1 m mol／l 4种Dntp),混合均匀.
2.每微克底物加大肠杆菌DNA聚合酶K1enow片段20～50单位,15℃反应20小时,此酶能识别cDNA 3’末端发卡环,并以其为引物,cDNA第一链为模板,开始第二链的合成.
3.加0.5 mol／l EDTA 2μl终止反应.取样电泳,以提取第一链同样的方法分离沉淀dsDNA.对于这样合成的dsDNA不是全长的DNA分子,所以,需要进一步用逆转录酶合成. 
4.溶解上述dsDNA在20μl水中,再加入：1mol／l Tris.HCl pH8.3)5μl,1 mol／l KCl 7μl,250m mol／l MgCl2 2μl,20m mol／l 4种‘dNTP各2.5μl,700m mol／l β-MCE 2μl,加重煎水到48μl,加逆转录酶2μl (40单位)、42℃保温反应1小时.
5.加0.5 mol／l EDTA 2μl终止反应,取样电泳,以同样方法抽提,分离沉淀dsDNA.
6.用两次合成的双链cDNA和单链cDNA在1.4％碱性琼脂糖凝胶上电泳,放射自显影后观察,如果dsDNA片段的长度是第一链cDNA的两倍,那么,合成便是成功的.
7.用核酸酶S1消化dsDNA,除去连接两条链的发卡环.
 

实验材料

RNA

试剂/试剂盒

α32PdNTP mRNA 甲基氢氧化汞 β-巯基乙醇 RNase抑制剂 引物01igo dT Tris-HCl MgCl2 KCl 逆转录酶 EDTA 酚-氯仿 乙醇 琼脂糖 Hepes DTT DNA聚合酶 核酸酶S1

仪器/耗材

SephadexG-100离心柱层析 离心管 恒温水浴锅 电泳仪 低温离心机

实验步骤

cDNA第一链的合成：
1.在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg）,100m mol/L甲基氢氧化汞1μl,室温反应l0分钟,使RNA变性.
2.加100m mol/l的β-巯基乙醇2μl和10m mol/l RNase抑制剂2μl,室温放置5分钟.β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用.
3.向上述反应混合物加lmg／ml的引物01igo dT(12～18聚体)10μl,1mol／l Tris.HCl(pH8.3)5μl,11mol／l, KCl7μl,250m mol／l,MgCl22μl,再加20 m mol／l的4种dNTP各2.5μl,逆转录酶2μl（40单位）,用水补充到50μl,充分混匀,42℃反应1～3小时. 
4.加0.5 EDTA(pH8.0)2μl终止反应,然后加150m mol／l NaOH 25μl,65℃反应1小时,或37℃8小时,水解mRNA模板,得到cDNA第一链,再加pH8.0,1m mol／l Tris.HCl,各25μl中和其pH.
5.测定放射活性,计算合成的DNA量.实际上,cDNA第一链的产量往往不会超过poltAmRNA用量的10%～30%.
6.用等体积的酚-氯仿抽提—次,取水相并用SephadexG-100离心柱层析将cDNA同剩余的dNTP分开,以2.5倍体积的95％冷乙醇沉淀.
7.合成的cDNA第—链在1.4％的碱性琼脂糖凝胶上电泳,用末端标记的pBR322限制性片段为分子量标准,电泳后,铺X-光片,进行放射自显影,确定cDNA第一链的大小. 
 
cDNA第二链的合成：
1.离心沉淀cDNA第一链,并重悬在50μl水中,加50μl 2×第二链缓冲液(0.2mol／l Hepes,pH6.9,20m mol／l MgCl2,5 m mol／l DTT,0.14 mol／l KCl,1 m mol／l 4种Dntp),混合均匀.
2.每微克底物加大肠杆菌DNA聚合酶K1enow片段20～50单位,15℃反应20小时,此酶能识别cDNA 3’末端发卡环,并以其为引物,cDNA第一链为模板,开始第二链的合成.
3.加0.5 mol／l EDTA 2μl终止反应.取样电泳,以提取第一链同样的方法分离沉淀dsDNA.对于这样合成的dsDNA不是全长的DNA分子,所以,需要进一步用逆转录酶合成. 
4.溶解上述dsDNA在20μl水中,再加入：1mol／l Tris.HCl pH8.3)5μl,1 mol／l KCl 7μl,250m mol／l MgCl2 2μl,20m mol／l 4种‘dNTP各2.5μl,700m mol／l β-MCE 2μl,加重煎水到48μl,加逆转录酶2μl (40单位)、42℃保温反应1小时.
5.加0.5 mol／l EDTA 2μl终止反应,取样电泳,以同样方法抽提,分离沉淀dsDNA.
6.用两次合成的双链cDNA和单链cDNA在1.4％碱性琼脂糖凝胶上电泳,放射自显影后观察,如果dsDNA片段的长度是第一链cDNA的两倍,那么,合成便是成功的.
7.用核酸酶S1消化dsDNA,除去连接两条链的发卡环.
 

经验交流

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