氯化锂沉淀法去除质粒DNA制备物中的小片段核酸_实验⽅法

实验原理

氯化锂沉淀法去除质粒制备物中小片段核酸（包括 DNA 和 RNA ) 的原理是基于两种核酸在氯化锂溶液中的溶解度有所不同。氯化锂是强脱水剂，可降低 RNA 的溶解性 ( Hearst and Vinograd 1961a, b），并剥离染色质上的蛋白质（Kondo 1979)。因此，质粒粗提物中的高分子质量 RNA 和蛋白质可在高浓度氯化锂溶液中形成沉淀，从而可通过低速离心加以分离（实例请见Kondo et al. 1991)。

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶剂

乙醇，异丙醇，LiCl ( 4 mol/L)，乙酸钠（3mol/L, pH 5.2)，TE ( pH 8.0)，含有浓度为 20 μg/ml RNase A 的 TE ( pH 8.0)。

2. 核酸和寡核苷酸

DNA 样品，CsCl 密度梯度离心纯化。

3. 离心机和转子

Sorvsll SS-34 转子或性能相同的替代转子

二、方法

1. 测定质粒制备物体积，加入 0.1 体积的 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 ) 和 2 倍体积的乙醇，置混合物于 4℃ 30 min。

2. 于 4℃ 以大于 10000 g ( > 9000 r/min, 用 Sorvsll SS-34 转子 ) 的转速离心 15 min 回收核酸沉淀，尽可能多地倾去上清液。而后打开管盖置于工作台上数分钟以蒸发乙醇。

3. 用含有 RNase A ( 浓度 ≥ 100 μg/ml ) 的 1 ml TE ( pH 8.0) 溶解湿的核酸沉淀。

4. 加入 3 ml 4 mol/L LiCl 溶液，置于冰上 30 min。

5. 于 4℃ 以 12000 g ( 10000 r/min，用 Sorvsll SS-34 转子）离心 15 min, 从沉淀的核酸中分离 DNA 质粒。

6. 将上清液转至一新的离心管，加入 6 ml 异丙醇，室温放置 30 min 以沉淀质粒 DNA。

7. 于 4℃ 以 12000 g ( 10000 r/min, 用 Sorvsll SS-34 转子）离心 15 min, 回收沉淀的质粒 DNA。

8. 小心倾去上清液，加入 5~10 ml 70% 乙醇，简单振荡离心管，而后于 4℃ 以 12000 g 离心 10 min。

9. 小心倾去上清液，打开管盖置于工作台上数分钟直至乙醇蒸发殆尽。

10. 用 TE ( pH 8.0 ) 溶解湿的 DNA 沉淀。

实验方法

氯化锂沉淀法去除质粒DNA制备物中的小片段核酸