石蜡切片法
实验原理
实验材料
实验步骤
一、材料准备：
1. 中性甲醛固定液：
甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度）100 mL
磷酸氢二钠 6.5 g
磷酸二氢钾（钠）4 g
双蒸水 900 mL
2. 1%盐酸乙醇液：
盐酸 1份
70%酒精 100份
3. 甘油蛋白贴片剂：
蛋白 50 ml
甘油 50 ml
水杨酸钠（防腐剂） 1 g
4. 配制
（1）将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫。
（2）然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。
（3）此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。
（4）最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。
二、实验步骤：
1. 取材
（1）颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。
（2）切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5 mmx5 mmx2 mm或10 mmx10 mmx2 mm 为宜。
（3）取下所需要的肝组织，切成一小块2~3 mm 厚。
2. 固定
（1）将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下
（2）立即投入中性福尔马林固定液中固定
（3）固定30~50 min。
3. 洗涤
材料经固定后，流水冲洗，数小时或过夜。
4. 脱水
（1）材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30 min。
（2）再放入95%、100%各2次，每次20 min。
5. 透明
（1）纯酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min（至透明为止）。
（2）由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。
（3）当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
（3）当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
6. 透蜡
（1）放入二甲苯和石蜡各半的混合液15 min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50~60分钟。
（2）透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。
（3）透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5 h。
7. 包埋
（1）包埋时，用镊子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上。
（2）从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。
（3）再将镊子在酒精灯上稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。
（4）再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。
8. 切片
（1）将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。
（2）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。
（3）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。
（4）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。
（5）调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4~10微米。
（6）一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40~50 r/min。
（7）切成的蜡带到20~30 cm 长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。
（8）用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。
（9）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。
9. 展片、贴片
打开水浴锅，使水温维持在40~45℃，另准备30%乙醇溶液。
（1）切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。
（2）用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上，使切片展开。
（3）小镊子轻轻地将连在一起的切片分开，用一个载玻片将切片完整，已展开的切片捞至温水中，使之充分展开。
（4）另取洁净的载玻片，捞起展开的切片，使其位于切片1/3处，另一端（磨边，粗糙的一端）磨面上标记或贴上标签，放于切片架上。
10. 脱蜡复水
（1）将水浴锅温度调至60℃，待水温控制在60℃时。
（2）将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内，放入水浴锅中，盖上盖子（可密封），30 min 至蜡熔化。
（3）之后，石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5 min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3~5 min，再放入蒸馏水中3 min。
11. 染色
（1）切片放入苏木精中染色约10~30 min。
（2）染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。
（3）室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。
12. 水洗
（1）用自来水流水冲洗约15 min。
（2）使切片颜色变蓝（或放入碱性水中也可）。
（3）但要注意流水不能过大，以防切片脱落。
13. 分化
（1）将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色。
（2）约2秒至数十秒钟，见切片变红，颜色较浅即可。
14. 漂洗
切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。
15. 脱水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5 min。
16. 复染
（1）用0.5%伊红乙醇液对比染色1~3 min。
（2）伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。
（3）反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。
17. 脱水Ⅱ
（1）将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色。
（2）然后放入无水乙醇中3~5 min。
（3）最后用吸水纸吸干多余的乙醇。
18. 透明
（1）切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5 min。
（2）二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。
（3）切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。
19. 封藏：中性树胶封存
因切片经二甲苯透明，使用中性树胶作为封藏剂，树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。
20. 封藏的方法：
（1）封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。
（2）材料透明后，在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上）。
（3）迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。
（4）如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。
（5）如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。
（6）染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。
三、免疫组化染色
1. 石蜡切片，步骤同前。切片经贴片后，60℃烤片30 min使蜡熔化，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，脱蜡。然后，将切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3~5 min，再放入蒸馏水中3 min，水化。
2. 脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4，具体看所用抗体及染色试剂说明）冲洗3次，每次3分钟。洗瓶冲洗。
3. 根据抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。可选步骤，具体见抗体说明书。
4. 每张切片加1滴或50 ul 3%过氧化氢，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。此步骤是对内源性过氧化物酶含量高的组织而言。
5. 除去PBS液，每张切片加1滴或50 ul 的第一抗体，室温下孵育60分钟或4℃过夜，具体参见每种抗体的说明书。PBS冲洗3次，每次3分钟。
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50 ul 即用型MaxVisionTM试剂或SP试剂，室温下孵育10~15分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
7. 除去PBS液，每张切片加2滴或100 ul新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3~5分钟（DAB）或37℃环境下10~30分钟（AEC）。
8. 自来水冲洗，苏木素复染10分钟，PBS或自来水冲洗返蓝。如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，步骤同H-E染色，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。
注意事项
一、取材注意事项
1. 取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
2. 切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
二、固定注意事项
1. 一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
2. 有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
3. 固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液。
4. 材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
三、脱水注意事项
1. 脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。
2. 在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
3. 在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
4. 在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
5. 如需过夜，应停留在70%酒精中。
6. 脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象。
四、透明注意事项
1. 使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。
2. 更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。
3. 在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。
五、透蜡注意事项
1. 尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度。
2. 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低。
3. 操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。
