1. PBS 溶解抗原为30 μg/ml，加100 μl/孔于PVDF 膜铺底的96 孔灭菌板过夜；

 

2. 第二天吸去包被液后，加5％FCS 的PRMI 1640 培养基100 μl 封闭1 小时，37℃；

 

3. 准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾淋巴细胞悬液）；

 

4. 从1 × 106/孔开始，按1:3 的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度，并做3 个复孔，37 ℃静置培养5 小时；

 

5. PBS 洗3～5 次，生物素化的抗鼠IgG 二抗孵育30 min；

 

6. PBS 洗3～5 次，链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育30 min；

 

7. PBS 洗3～5 次，用底物BCIP/NBT 显色，显微镜下观察显色反应，显色后及时终止反应；

 

8. 计数每孔中的斑点数目，计算每10⁶ 个脾细胞中抗体分泌细胞数量。