实验方法

无去垢剂的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

难度系数: 3.0

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无去垢剂的电泳是一种有用的定性分析方法,也是一种分离和纯化的技术。大规模的非变性凝胶可用来在不使蛋白质变性的条件下纯化活性蛋白质。对在中性 pH 下有强的净电荷的蛋白质进行非变性 PAGE 是很方便的。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南,作者:朱厚础。

无去垢剂的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

实验原理

实验步骤

材料与设备

丙烯酰胺

双丙烯酰胺

Tris 碱

蔗糖

HCl(1mol/L)

过硫酸按(0.3 g/ml)

N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)

平板凝胶电泳装置

电源(250V)

考马斯亮蓝染料

试剂

上槽缓冲液

下槽缓冲液

样品缓冲液(5x)

(配方,见「试剂的配制」,PP.82~83)

操作程序

1) 将下列成分溶解于 H20 中并调节体积至 47.9 ml

丙烯酰胺                                                     6.0 g

双丙烯酰胺                                                 0.144 g

Tris 碱                                                         2.18 g

蔗糖                                                            4.80 g

HCl( 1mol/L)                                                2.88 ml

2) 溶液置于具侧管的烧瓶中真空脱气。

3) 加 100ul 0.3 g/ml 过硫酸铵,缓缓旋动使之旋入溶液中。

4) 加 5ul TEMED, 迅速混匀后,将凝胶溶液注入玻板之间。

5) 轻轻叩击玻板,释出所有气泡,插入梳子,用水覆盖凝胶至凝结。

6) 将凝胶置于电泳装置中。将上槽缓冲液和下槽缓冲液倒入相应的槽中。

7) 将样品以 4:1 与 5X 样品缓冲液 (如,80ul 样品+20ul 5x 样品缓冲液) 混合。

8) 小心地拔出梳子,加样于凝胶孔中,200V 恒压下电泳。

9) 按 Laemmli 凝胶那样,用考马斯亮蓝染色(见附录 5)。

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