通过重叠延伸和基因 SOEing 进行 PCR 突变实验
实验原理
1. 缓冲液、溶液和试剂
无菌 H2O
2. 酶和酶缓冲液
10XPCR 缓冲液(Roche),包含 100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/L,KCl 和 15 mml/LMgCl2
限制性酶和缓冲液
Taq DNA 聚合酶(Roche)
3. 核酸和寡核苷酸
10X dNTP, 商品出售的 dNTP 溶液(AmershamBiosciences) 是 100umol/L 浓度的储存液,可以用无菌水稀释。
PCR 模板
5'和 3'引物
4. 特殊设备
DNA 测序装置
热循环仪
5. 其他
琼脂糖,分离 DNA 片段所需的琼脂糖浓度依赖于需要分离的片段的大小。依经验,0.8%~1% 的 SeaKem GTG 琼脂糖(Cambrex)(用 1XTAE 配制)一般都能够令人满意地分离 0.25~2kb 大小的 DNA 片段。
琼脂糖凝胶电泳设备
GENECLEANⅡ试剂盒(BIO101)
6. 载体和菌株
PCR 产物测序所需的克隆载体和菌株。
二、方法
1. 通过重叠延伸进行 PCR 突变
(1)在独立的微量离心管中进行 PCR 反应生成产物 AB 和 CD(参见图 32-1)。这些反应混合物能够在室温下混合。
(2)反应进行 30 个循环(94℃ 1min, 50℃ 1min, 72℃ 2 min)。
(3)将每个反应的所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳。
(4)切下目标条带(即产物 AB 和 CD),用 GENECLEANUⅡ试剂盒回收 DNA 片段。
(5)在一个新的微量离心管中进行重叠延伸反应。
这一反应对于加入的模扳量不十分敏感。通常每种模板可以使用 10~100ng。引物 a 和 d 也可以在PCR 反应的开始就加入。
(6)参照上面的步骤 2 进行 PCR 扩增。
(7)将反应物进行琼脂糖凝胶电泳,切下目标条带(即产物 AD),参照步骤 4 回收 DNA片段。
(8)纯化的突变产物 AD 随后可以被适当的限制性酶所消化,然后连接到一个合适的克隆载体上进行后续的转化和测序。
2. 基因 SOEing
(1)在独立的微量离心管中进行 PCR 反应,以分别产生来自基因 1 的产物 WX 和来自基因 2 的产物 YZ(图 32-2)。
(2)反应进行 30 个循环(94℃ 1min, 50℃ 1min,72℃ 2min)。
(3)将每个反应的所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳。
(4)切下目标条带(即产物 WX 和 YZ), 用 GENECLEANB 试剂盒回收 DNA 片段。
(5)在一个微量离心管中进行 SOEing 反应。
(6)参照上面的步驟 2 进行 PCR 扩增。
(7)将反应物进行琼脂糖凝胶电泳,切下目标条带(即产物 WZ), 参照步骤 4 回收 DNA 片段。
(8)纯化的突变产物 WZ 随后可以被适当的限制性酶所消化,然后连接到一个合适的克隆载体上进行后续的转化和测序。
实验步骤
1. 缓冲液、溶液和试剂
无菌 H2O
2. 酶和酶缓冲液
10XPCR 缓冲液(Roche),包含 100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/L,KCl 和 15 mml/LMgCl2
限制性酶和缓冲液
Taq DNA 聚合酶(Roche)
3. 核酸和寡核苷酸
10X dNTP, 商品出售的 dNTP 溶液(AmershamBiosciences) 是 100umol/L 浓度的储存液,可以用无菌水稀释。
PCR 模板
5'和 3'引物
4. 特殊设备
DNA 测序装置
热循环仪
5. 其他
琼脂糖,分离 DNA 片段所需的琼脂糖浓度依赖于需要分离的片段的大小。依经验,0.8%~1% 的 SeaKem GTG 琼脂糖(Cambrex)(用 1XTAE 配制)一般都能够令人满意地分离 0.25~2kb 大小的 DNA 片段。
琼脂糖凝胶电泳设备
GENECLEANⅡ试剂盒(BIO101)
6. 载体和菌株
PCR 产物测序所需的克隆载体和菌株。
二、方法
1. 通过重叠延伸进行 PCR 突变
(1)在独立的微量离心管中进行 PCR 反应生成产物 AB 和 CD(参见图 32-1)。这些反应混合物能够在室温下混合。
(2)反应进行 30 个循环(94℃ 1min, 50℃ 1min, 72℃ 2 min)。
(3)将每个反应的所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳。
(4)切下目标条带(即产物 AB 和 CD),用 GENECLEANUⅡ试剂盒回收 DNA 片段。
(5)在一个新的微量离心管中进行重叠延伸反应。
这一反应对于加入的模扳量不十分敏感。通常每种模板可以使用 10~100ng。引物 a 和 d 也可以在PCR 反应的开始就加入。
(6)参照上面的步骤 2 进行 PCR 扩增。
(7)将反应物进行琼脂糖凝胶电泳,切下目标条带(即产物 AD),参照步骤 4 回收 DNA片段。
(8)纯化的突变产物 AD 随后可以被适当的限制性酶所消化,然后连接到一个合适的克隆载体上进行后续的转化和测序。
2. 基因 SOEing
(1)在独立的微量离心管中进行 PCR 反应,以分别产生来自基因 1 的产物 WX 和来自基因 2 的产物 YZ(图 32-2)。
(2)反应进行 30 个循环(94℃ 1min, 50℃ 1min,72℃ 2min)。
(3)将每个反应的所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳。
(4)切下目标条带(即产物 WX 和 YZ), 用 GENECLEANB 试剂盒回收 DNA 片段。
(5)在一个微量离心管中进行 SOEing 反应。
(6)参照上面的步驟 2 进行 PCR 扩增。
(7)将反应物进行琼脂糖凝胶电泳,切下目标条带(即产物 WZ), 参照步骤 4 回收 DNA 片段。
(8)纯化的突变产物 WZ 随后可以被适当的限制性酶所消化,然后连接到一个合适的克隆载体上进行后续的转化和测序。