准备插入片段实验
实验原理
研究表明很多种 DNA 聚合酶（比如，T7、修饰过的 T7、Taq、Vent、Tth 和 Klenow)具有脱氧核苷酸末端转移酶（Tdt) 活性（Clark1988;Hu1993)。DNA 聚合酶将 PCR 产物 3'端的核苷酸延伸，这个反应具有核苷酸以及聚合酶的专一性。比如，：Taq DNA 聚合酶产生的 PCR 产物更倾向于按下面形式修饰（+表示延伸；一表示没有添加核苷酸）。
聚合酶将碱基加到模板上可能并没有一致性的模式。因此，不能认为所有的 DNA 聚合酶都能够用来产生平末端 DNA 片段。然而，对于某些 DNA 聚合酶，可以通过 PCR 引物 5'端核苷酸来控制 PCR 产物的 3'端得到哪一种核苷酸（Hu1993;Costa and Weiner1994d)。利用单磷酸化载体进行定向克隆，插入片段的单磷酸化可以通过在 PCR 前激酶处理引物来实现。更好的办法是，在合成 PCR 引物时通过化学方法添加一个 5'磷酸基团。合成带有 5'-磷酸基团的 PCR 引物可以保证所有的单链 DNA 都被单磷酸化。激酶处理的优点是所有已有的各套引物都能被修饰，从而可以应用于单磷酸化载体的定向克隆。T4 多聚核苷酸激酶处理是一个简单而又迅速的技术。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
ATP(10 mmol/L)
2. 酶和酶缓冲液
激酶缓冲液（lmmol/L 氯化镁，100 mmol/LTris-HCl、pH7.5,5 mmol/L 二硫苏糖醇)
T4 多聚核苷酸激酶（10U)
3. 核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物（1ug/ul)
4. 专用设备
两个水浴锅，预先调到 37°C 和 95°C
二、方法
1. 在离心管中加入如下成分。
激酶缓冲液，10X 3ul
ATP，10mmol 0.5ul
T4DNA 激酶（10U/ul) 1ul
被选引物 5ug
H20 补充到 30ul
2.37°C 温浴1h。
3.95°C 煮沸反应体系，使 T4DNA 激酶失活。
第 2 阶段：PCR 扩增
因为没有哪个操作指南指出了哪种缓冲条件可以用于各种不同类型的 DNA 引物-模板系统，所以通常要检测一系列的 PCR 缓冲液。已经有许多 PCR 优化试剂盒可以用来检测几种不同的缓冲液成分 [比如，Opti-Prime PCR 优化试剂盒（Stratagene) 和 The PCR Optimizer(Invitrogen)]。通过改变某些 PCR 缓冲液成分和利用 PCR 热启动酶，可以提高 PCR 产物的得率和特异性。另外，加入终浓度为 0.8~1.6mol/L 的甜菜碱，可以提高 DNA 的扩增效率，这是因为甜菜碱可以抑制富含 GC 的区域形成二级结构。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
甜菜碱溶液，PCR 级（Sigma)
dNTP 储存液（包含所有的 4 种 dNTP，每种都是 100 mml/L)
TE 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶缓冲液
克隆用的 P/mDNA 聚合酶（Stratagene)
PCR 缓冲液，10X(随酶一起购得）或者 PCR 优化缓冲液；比如，Opti-Prime PCR 优化试剂盒（Stratagene) 或 The PCR Optimizer(Invitrogen)
热稳定的 DNA 聚合酶（5U); 比如，Taq DNA 聚合酶，TaqBead 热启动聚合酶（Promega)，高保其 Platinum Taq DNA 聚合酶（Invitrogen)，AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)
3. 核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物
模板 DNA(1~50ng 质粒）
4. 专用设备
PCR 仪
5. 额外项目
琼脂糖凝胶电泳设备和试剂，包括溴化乙锭
可以选择：PCR 增强剂，比如，Taq Extender PCR 添加剂（Stratagene)，PCRx 增强系统（Invitrogen)
二、方法
1. 冰上，在一个 0.5 ml(原文为 ul—译者改）无菌离心管中建立 25ul 体系。按顺序加入如下试剂。
10XDNA 聚合酶缓冲液（最终为 1X) 2.5ul
模板 DNA(1~50ng 质粒或者是 105~106 目标分子*） 1~10ul
dNTP 储存液（包含所有的 4 种 dNTP，每种都是 10 mmol/L) 0.5ul
甜菜碱溶液（5mol/L) 2.5ul
上游引物（4ug/ul) 0.25ul
下游引物（4ug/ul) 0.25ul
热稳定的 DNA 聚合酶（5U/ul) 0.25ul
可选择：Taq Extender PCR 添加剂（5U)(额外的） 0.25ul
H20 补充到 25ul
*对于 3X105 目标：1ug 人单拷贝基因组 DNA;10ng 酵母 DNA;1% 的 M13 噬菌斑。
2. 混合均匀，应该立即进行 PCR 扩增。
3. 在一个有热盖的 PCR 仪上进行 PCR(如果没有热盖，应该用矿物油覆盖反应体系），按下面的建议设定温度程序。
4. 温度循环完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的保真性和得率。1~5ul PCR产物中的 DNA 片段可以在琼脂糖凝胶电泳中被溴化乙锭染色而检测出来。已知浓度的对照 DNA 可以用作 PCR 产物大小和浓度的参照。
第 3 阶段：用 Pfu DNA 聚合酶抛光 PCR 产物的末端
为配合某些 DNA 聚合酶而进行的引物的优化设计在 PCR 中只能很少地增加平末端片段的数目。要绝对地避免使用传统的 Klenow 聚合酶来抛光末端，因为它还保持着相当高的外切酶活性。幸运的是，T4 和 PfuDNA 聚合酶没有任何的 DNA 外切酶活性或 Tdt 活性，因此可以在 PCR 后用它们来产生平末端（见图 28-4)(Hu1993;Costa and Weiner1994c，d)。
PCR 抛光是用 DNA 聚合酶除去所有 PCR 产物的 3'端核苷酸延伸。产生的拋光分子在 T4DNA 连接酶的作用下可以以很高的效率和平末端克隆载体连接。在连接前拋光 PCR 产物的末端能够提高整个重组克隆的效率（Costa and Weiner1994c，d;Weiner et al.1994)。
低于 50°C 时 Pfu DNA 聚合酶基本上没有活性。这就可以让连接反应在 4~25°C 进行，而且在 72°C Pfu 拋光步骤后直接进入连接反应。这就不需要在连接反应前抽提酶，而用 T4 DNA 聚合酶拋光时就需要在连接反应前抽提酶。只要用少量的 PCR 产物，Pfu 拋光只需 30 min 就可以产生高保真的平末端 DNA 片段。下面略述了 Pfu 抛光的大概步骤，在 PCR 后可以直接进行 Pfu 抛光或者在 PCR 产物纯化后进行。
在 Pfu 拋光之前，最好先进行琼脂糖凝胶电泳估计一下 PCR 产物的大致浓度，并确定其正确性.PCR 拋光只用 PCR 扩增反应产物的一部分，并且能够拋光体系中所有存在的 DNA 片段。在一个典型的 25ulPCR 扩增反应中，取 5~10ul 产物进行拋光即可。
因为常规的 PCR 克隆程序需要用少董的 DNA 插入物（1~4ul），可以直接取 5~10M1PCR 产物进行末端拋光反应。如果在 PCR 后直接逬行末端拋光反应，温度循环中剩下的 dNTP 和反应缓冲液足够进行拋光反应（见下面）。沉淀或凝胶回收 PCR 产物也可以提高末端拋光的效率，然而如果用纯化的 PCR 产物做末端抛光就需要加入反应缓冲液和 dNTP 混合物。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 储存液（包含所有的 4 种 dNTP，每种都是 100 mmol/L), 方法 B
2. 酶和酶缓冲液
克隆化的 Pfu DNA 聚合酶（2.5U/ul)
克隆化的 Pfu 缓冲液，10X(公司提供）
3. 核酸和寡核苷酸
PCR 产物，纯化的（方法 B) 和未纯化的（方法 A)
4. 专用设备
水浴，预先调到 72°C
二、方法 A—抛光未纯化的 PCR 产物
1. 拋光 PCR 制备的 DNA 片段时，把 PCR 产物直接从 PCR 反应管中转移到一个 0.5 ml 无菌离心管，按顺序加入以下试剂。
5~10ulPCR 产物
1ul 克隆化的 Pfu DNA 聚合酶（2.5U)
加入 ddH20 至终体积为10ul
轻轻地混匀各种成分，用热盖温浴（如果没有热盖，应该用矿物油覆盖反应体系）
2.72°C 温浴 30 min, 拋光反应。
3.30 min 温浴后，把反应置于冰上。
4. 末端拋光的 DNA 片段可以直接加到一个连接反应中。
三、方法 B—Pfu 抛光纯化过的 PCR 产物
1. 拋光纯化过的 PCR 产物时，移取沉淀好的 PCR 产物到一个无菌 0.5 ml 离心管，并按顺序加入下列试剂。
5~10ul 沉淀 PCR 产物
1ul10X 克隆化 Pfu DNA 聚合酶缓冲液
1uldNTP 混合物（总体是 10 mmol/L，每个三磷酸核苷酸是 2.5 mmol/L)
1ul 克隆化 DNA 聚合酶（2.5U)
用 ddH20 补充到终体积为 10ul
轻轻地混匀各种成分，在热盖中溫浴（如果没有用热盖温浴，需要用矿物油覆盖反应物）
2.72°C 温浴拋光反应体系 30 min。
3.30 min 温浴完成后，把反应体系置于冰上。
4. 末端拋光的 DNA 片段可以直接加入到连接反应体系中。
PCR 产物纯化(可选择)
在进行克隆方案以前，用乙酸铵沉淀除去过剩的 PCR 引物，可以提高重组体的百分比。PCR 产物可以按下面方案盐析出来。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
乙酸铵，4mol/L
乙醇，100% 和 70%
STE 缓冲液，10X(1mol/LNaCl，200 mmol/L Tris-HCl、pH7.5，100 mmol/L EDTA)
TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)
2. 专用设备
真空干燥仪
二、方法
1. 加入 0.1 倍体积的 STE 缓冲液。
2. 向样品中加入等体积的 4mol/L 乙酸铵。
3. 加入 2.5 倍体积室温平衡过的 100% 乙醇。
4. 立即以 12000 g、10min 室温下离心沉淀 DNA，小心倒掉上清液。
5. 加入 200ul 70%(体积分数）乙醇。
6. 以 12000 g、10min 室温下离心，小心倒掉上清液，在其空仪中干燥沉淀。
7. 用原始体积大小的 TE 缓冲液重悬 DNA,4°C 保存。
仪器/耗材
实验步骤
研究表明很多种 DNA 聚合酶（比如，T7、修饰过的 T7、Taq、Vent、Tth 和 Klenow)具有脱氧核苷酸末端转移酶（Tdt) 活性（Clark1988;Hu1993)。DNA 聚合酶将 PCR 产物 3'端的核苷酸延伸，这个反应具有核苷酸以及聚合酶的专一性。比如，：Taq DNA 聚合酶产生的 PCR 产物更倾向于按下面形式修饰（+表示延伸；一表示没有添加核苷酸）。
聚合酶将碱基加到模板上可能并没有一致性的模式。因此，不能认为所有的 DNA 聚合酶都能够用来产生平末端 DNA 片段。然而，对于某些 DNA 聚合酶，可以通过 PCR 引物 5'端核苷酸来控制 PCR 产物的 3'端得到哪一种核苷酸（Hu1993;Costa and Weiner1994d)。利用单磷酸化载体进行定向克隆，插入片段的单磷酸化可以通过在 PCR 前激酶处理引物来实现。更好的办法是，在合成 PCR 引物时通过化学方法添加一个 5'磷酸基团。合成带有 5'-磷酸基团的 PCR 引物可以保证所有的单链 DNA 都被单磷酸化。激酶处理的优点是所有已有的各套引物都能被修饰，从而可以应用于单磷酸化载体的定向克隆。T4 多聚核苷酸激酶处理是一个简单而又迅速的技术。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
ATP(10 mmol/L)
2. 酶和酶缓冲液
激酶缓冲液（lmmol/L 氯化镁，100 mmol/LTris-HCl、pH7.5,5 mmol/L 二硫苏糖醇)
T4 多聚核苷酸激酶（10U)
3. 核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物（1ug/ul)
4. 专用设备
两个水浴锅，预先调到 37°C 和 95°C
二、方法
1. 在离心管中加入如下成分。
激酶缓冲液，10X 3ul
ATP，10mmol 0.5ul
T4DNA 激酶（10U/ul) 1ul
被选引物 5ug
H20 补充到 30ul
2.37°C 温浴1h。
3.95°C 煮沸反应体系，使 T4DNA 激酶失活。
第 2 阶段：PCR 扩增
因为没有哪个操作指南指出了哪种缓冲条件可以用于各种不同类型的 DNA 引物-模板系统，所以通常要检测一系列的 PCR 缓冲液。已经有许多 PCR 优化试剂盒可以用来检测几种不同的缓冲液成分 [比如，Opti-Prime PCR 优化试剂盒（Stratagene) 和 The PCR Optimizer(Invitrogen)]。通过改变某些 PCR 缓冲液成分和利用 PCR 热启动酶，可以提高 PCR 产物的得率和特异性。另外，加入终浓度为 0.8~1.6mol/L 的甜菜碱，可以提高 DNA 的扩增效率，这是因为甜菜碱可以抑制富含 GC 的区域形成二级结构。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
甜菜碱溶液，PCR 级（Sigma)
dNTP 储存液（包含所有的 4 种 dNTP，每种都是 100 mml/L)
TE 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，lmmol/LEDTA、pH8.0)
2. 酶和酶缓冲液
克隆用的 P/mDNA 聚合酶（Stratagene)
PCR 缓冲液，10X(随酶一起购得）或者 PCR 优化缓冲液；比如，Opti-Prime PCR 优化试剂盒（Stratagene) 或 The PCR Optimizer(Invitrogen)
热稳定的 DNA 聚合酶（5U); 比如，Taq DNA 聚合酶，TaqBead 热启动聚合酶（Promega)，高保其 Platinum Taq DNA 聚合酶（Invitrogen)，AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)
3. 核酸和寡核苷酸
寡核苷酸引物
模板 DNA(1~50ng 质粒）
4. 专用设备
PCR 仪
5. 额外项目
琼脂糖凝胶电泳设备和试剂，包括溴化乙锭
可以选择：PCR 增强剂，比如，Taq Extender PCR 添加剂（Stratagene)，PCRx 增强系统（Invitrogen)
二、方法
1. 冰上，在一个 0.5 ml(原文为 ul—译者改）无菌离心管中建立 25ul 体系。按顺序加入如下试剂。
10XDNA 聚合酶缓冲液（最终为 1X) 2.5ul
模板 DNA(1~50ng 质粒或者是 105~106 目标分子*） 1~10ul
dNTP 储存液（包含所有的 4 种 dNTP，每种都是 10 mmol/L) 0.5ul
甜菜碱溶液（5mol/L) 2.5ul
上游引物（4ug/ul) 0.25ul
下游引物（4ug/ul) 0.25ul
热稳定的 DNA 聚合酶（5U/ul) 0.25ul
可选择：Taq Extender PCR 添加剂（5U)(额外的） 0.25ul
H20 补充到 25ul
*对于 3X105 目标：1ug 人单拷贝基因组 DNA;10ng 酵母 DNA;1% 的 M13 噬菌斑。
2. 混合均匀，应该立即进行 PCR 扩增。
3. 在一个有热盖的 PCR 仪上进行 PCR(如果没有热盖，应该用矿物油覆盖反应体系），按下面的建议设定温度程序。
4. 温度循环完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的保真性和得率。1~5ul PCR产物中的 DNA 片段可以在琼脂糖凝胶电泳中被溴化乙锭染色而检测出来。已知浓度的对照 DNA 可以用作 PCR 产物大小和浓度的参照。
第 3 阶段：用 Pfu DNA 聚合酶抛光 PCR 产物的末端
为配合某些 DNA 聚合酶而进行的引物的优化设计在 PCR 中只能很少地增加平末端片段的数目。要绝对地避免使用传统的 Klenow 聚合酶来抛光末端，因为它还保持着相当高的外切酶活性。幸运的是，T4 和 PfuDNA 聚合酶没有任何的 DNA 外切酶活性或 Tdt 活性，因此可以在 PCR 后用它们来产生平末端（见图 28-4)(Hu1993;Costa and Weiner1994c，d)。
PCR 抛光是用 DNA 聚合酶除去所有 PCR 产物的 3'端核苷酸延伸。产生的拋光分子在 T4DNA 连接酶的作用下可以以很高的效率和平末端克隆载体连接。在连接前拋光 PCR 产物的末端能够提高整个重组克隆的效率（Costa and Weiner1994c，d;Weiner et al.1994)。
低于 50°C 时 Pfu DNA 聚合酶基本上没有活性。这就可以让连接反应在 4~25°C 进行，而且在 72°C Pfu 拋光步骤后直接进入连接反应。这就不需要在连接反应前抽提酶，而用 T4 DNA 聚合酶拋光时就需要在连接反应前抽提酶。只要用少量的 PCR 产物，Pfu 拋光只需 30 min 就可以产生高保真的平末端 DNA 片段。下面略述了 Pfu 抛光的大概步骤，在 PCR 后可以直接进行 Pfu 抛光或者在 PCR 产物纯化后进行。
在 Pfu 拋光之前，最好先进行琼脂糖凝胶电泳估计一下 PCR 产物的大致浓度，并确定其正确性.PCR 拋光只用 PCR 扩增反应产物的一部分，并且能够拋光体系中所有存在的 DNA 片段。在一个典型的 25ulPCR 扩增反应中，取 5~10ul 产物进行拋光即可。
因为常规的 PCR 克隆程序需要用少董的 DNA 插入物（1~4ul），可以直接取 5~10M1PCR 产物进行末端拋光反应。如果在 PCR 后直接逬行末端拋光反应，温度循环中剩下的 dNTP 和反应缓冲液足够进行拋光反应（见下面）。沉淀或凝胶回收 PCR 产物也可以提高末端拋光的效率，然而如果用纯化的 PCR 产物做末端抛光就需要加入反应缓冲液和 dNTP 混合物。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 储存液（包含所有的 4 种 dNTP，每种都是 100 mmol/L), 方法 B
2. 酶和酶缓冲液
克隆化的 Pfu DNA 聚合酶（2.5U/ul)
克隆化的 Pfu 缓冲液，10X(公司提供）
3. 核酸和寡核苷酸
PCR 产物，纯化的（方法 B) 和未纯化的（方法 A)
4. 专用设备
水浴，预先调到 72°C
二、方法 A—抛光未纯化的 PCR 产物
1. 拋光 PCR 制备的 DNA 片段时，把 PCR 产物直接从 PCR 反应管中转移到一个 0.5 ml 无菌离心管，按顺序加入以下试剂。
5~10ulPCR 产物
1ul 克隆化的 Pfu DNA 聚合酶（2.5U)
加入 ddH20 至终体积为10ul
轻轻地混匀各种成分，用热盖温浴（如果没有热盖，应该用矿物油覆盖反应体系）
2.72°C 温浴 30 min, 拋光反应。
3.30 min 温浴后，把反应置于冰上。
4. 末端拋光的 DNA 片段可以直接加到一个连接反应中。
三、方法 B—Pfu 抛光纯化过的 PCR 产物
1. 拋光纯化过的 PCR 产物时，移取沉淀好的 PCR 产物到一个无菌 0.5 ml 离心管，并按顺序加入下列试剂。
5~10ul 沉淀 PCR 产物
1ul10X 克隆化 Pfu DNA 聚合酶缓冲液
1uldNTP 混合物（总体是 10 mmol/L，每个三磷酸核苷酸是 2.5 mmol/L)
1ul 克隆化 DNA 聚合酶（2.5U)
用 ddH20 补充到终体积为 10ul
轻轻地混匀各种成分，在热盖中溫浴（如果没有用热盖温浴，需要用矿物油覆盖反应物）
2.72°C 温浴拋光反应体系 30 min。
3.30 min 温浴完成后，把反应体系置于冰上。
4. 末端拋光的 DNA 片段可以直接加入到连接反应体系中。
PCR 产物纯化(可选择)
在进行克隆方案以前，用乙酸铵沉淀除去过剩的 PCR 引物，可以提高重组体的百分比。PCR 产物可以按下面方案盐析出来。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
乙酸铵，4mol/L
乙醇，100% 和 70%
STE 缓冲液，10X(1mol/LNaCl，200 mmol/L Tris-HCl、pH7.5，100 mmol/L EDTA)
TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)
2. 专用设备
真空干燥仪
二、方法
1. 加入 0.1 倍体积的 STE 缓冲液。
2. 向样品中加入等体积的 4mol/L 乙酸铵。
3. 加入 2.5 倍体积室温平衡过的 100% 乙醇。
4. 立即以 12000 g、10min 室温下离心沉淀 DNA，小心倒掉上清液。
5. 加入 200ul 70%(体积分数）乙醇。
6. 以 12000 g、10min 室温下离心，小心倒掉上清液，在其空仪中干燥沉淀。
7. 用原始体积大小的 TE 缓冲液重悬 DNA,4°C 保存。
